Ларвіцидний потенціал п’яти відібраних бабок-німф у Шрі-Ланці закінчився Aedes aegypti (Лінней) Личинки в лабораторних налаштуваннях

1 Департамент природних ресурсів факультету прикладних наук Університету Сабарагамуви Шрі-Ланки, Шрі-Ланка

2 Кафедра інженерії біосистем, факультет сільського господарства та управління насадженнями, Університет Шей-Ланки, Шрі-Ланка

3 Кафедра біосистем, факультет сільського господарства та управління насадженнями, Університет Шей-Ланки, Шрі-Ланка

4 HELPO Eco Green Ltd., місто Талбот, Галле, Шрі-Ланка

Анотація

1. Передумови

Комарі становлять одну з основних небезпек для здоров’я людини, оскільки вони відіграють важливу роль у передачі переносних хвороб [1]. Серед них денге - це швидко зростаюча вірусна хвороба, що передається комарами, яка широко поширюється по всьому світу. Щороку трапляється близько 50 мільйонів вірусних інфекцій денге, і практично 2,5 мільярда людей проживають в ендемічних країнах денге [2]. Приблизно 1,8 мільярда людей (понад 70%) перебувають під загрозою вірусної інфекції денге в країнах-членах Західної частини Тихого океану та Південно-Східної Азії Всесвітньої організації охорони здоров’я, що становить приблизно 75% недавнього глобального тягаря захворювань через Лихоманка денге [3].

Шрі-Ланка вже більше двох десятиліть уражається епідеміями лихоманки денге (DF) та геморагічної лихоманки денге (DHF). На Шрі-Ланці, Aedes aegypti залишаються основним вектором, підтримуваним Ae. albopictus як вторинний вектор. Вірусні інфекції денге повідомляються із Шрі-Ланки з середини 1960-х років. DF був серологічно підтверджений в 1962 р., І існування DF у всіх великих містах, розташованих нижче висоти 1200 м, було підтверджено протягом періоду 1976–1978 рр. [4]. Зі зміною серотипу (ів) на Шрі-Ланці спостерігається тривожне зростання захворюваності на денгу, що спричиняє найбільшу кількість випадків денге, як колись, 186, 101 із понад 440 смертельними випадками у 2017 році [5].

Методи біологічного контролю намагаються використовувати природних ворогів комарів на різних стадіях життєвого циклу як хижаків, так і паразитів. Великим різноманіттям живих організмів, включаючи мікроби, гриби, найпростіші, нематоди, інші безхребетні та хребетні хижаки, визнано потенційними агентами боротьби з комарами [10, 11]. Серед різних біологічних засобів боротьби з хижими комахами, такими як самозакохані та бабки, німфи отримали велике значення як значущі хижаки багатьох мікробезхребетних, включаючи личинки Едіс комарі [11–13]. І самці, і бабки належать до ордена Одоната, зокрема до підрядів Zygoptera та Anisoptera, відповідно. В даний час із Шрі-Ланки зареєстровано загалом 124 види, що складаються з 66 видів, що належать до підряду Anisoptera та 58 видів до підряду Zygoptera [14].

І нимфа, і доросла особа цих двох підрядів передують комарам [1]. Висока здатність до розмноження, пристосованість до навколишнього середовища, перевага цільової популяції шкідників у існуванні замісної природної здобичі та загальна взаємодія з природними організмами визнані ключовими характеристиками будь-якого біологічного контролюючого агента [9]. Серед різних харчових уподобань бабок німф, такі малі личиночні форми, як Едіс личинки залишаються улюбленими ними навіть у природних середовищах існування, тоді як дорослі бабки також випереджають дорослих комарів [15, 16]. Крім того, одонати не мають шкідливого впливу на людину [17, 18]. Багато країн світу, особливо південно-азіатського регіону, оцінили практичну ефективність використання німфальних одонатів як засобів боротьби з комарами. М’янма [19] та Індія [12, 20] успішно використовують різноманітні бабки як потенційний біологічний ресурс для регулювання личиночних популяцій комарів-переносників та шкідників [18].

Починаючи з 60-х років влади, що працюють над боротьбою з денге, в Шрі-Ланці більше зосереджувались на боротьбі з переносниками хімічних речовин, а зусилля на біологічному контролі над Едіс обмежується лише оцінкою доцільності використання личинок кількох видів копепод та риб [21]. Незважаючи на надзвичайне різноманіття та широке поширення бабок у країні, Шрі-Ланка не звертала жодної уваги на бабок як потенційного агента біоконтролю Едіс комарів. З реалізацією обмежень у поточній діяльності з боротьби з векторами країна повинна перейти до простих, ефективних та екологічно чистих методів управління векторами. Тому поточне дослідження було розроблено для оцінки потенціалу використання бабок як біоконтрольного агента для придушення векторної популяції Ae. aegypti з метою управління епідеміями денге в межах країни.

2. Методи

2.1. Створення Aedes aegypti Колонія

Збір дорослих комарів проводився в районі медичного працівника Нарангодапалуви (МОЗ) м. Рагама, а захоплених комарів транспортували до лабораторії для масового вирощування у відділі молекулярної медицини медичного факультету університету Келанія, Шрі-Ланка. У лабораторії лише Ae. aegypti комарі були відокремлені шляхом морфологічної ідентифікації добре підготовленими ентомологами. Яйця, відкладені одинаком Ae. aegypti кровопролиті самки були використані для створення москітної колонії в Росії Ae. aegypti. Кожну колонію утримували в клітках розміром 24 х 24 х 24 см із сітчастим екраном зверху, при циклі 12:12 (світло: темно) при стандартних умовах (при 27 ± 2 ° C та вологості 75 ± 5%), дотримуючись стандартні протоколи, запропоновані Гунатілакою та ін. [22, 23]. Кров великої рогатої худоби використовували для годування комарів за допомогою техніки годування металевими пластинами [23].

Відкладені ними яйця дозволялося висиджувати протягом 2-3 днів після яйцекладки. Личинок першої інстанції (L1) переносили щодня з чашок для яйцекладки на пластикові лотки (40 × 25 × 6 см) з 1000 мл води, зберігаючи при цьому щільність личинок 750-800 особин на лоток. Приблизно 1 мл стандартної дієти для личинок, що містить шрот тунця (50%), порошок бичачої печінки (36%) і дріжджі (14%), додавали в лотки для личинок двічі на день, поки личинки не вирощувались до 4-го етапу. етап (L4) [23]. Звідти утворені личинки 4-ї категорії були використані для випробувань хижацтва, як описано нижче.

2.2. Створення колоній нірф бабок

3. Експерименти з хижацтвом

3.1. Оцінка хижацької ефективності різних видів бабок

Бабки різних видів виховували до останньої стадії, а довжину їх тіла вимірювали з точністю до міліметра за допомогою лінійки. Добре вирощена особина кожного виду була введена в окремі резервуари для зберігання (підтримувались, як описано вище) і голодувала протягом 12 годин [13]. Сто личинок 4-ї категорії Aedes aegypti Вирощені в лабораторних умовах спочатку вводили в кожен скляний резервуар, тоді як аналогічний скляний резервуар без будь-яких бабок-німф використовувався як контроль. У випадку, коли більше 75% від Едіс личинки були видобуті, нові партії личинок 4-го віку були введені в скляні резервуари, щоб підтримувати 100 особин на щільність личинок резервуару протягом доби. Після закінчення 24 годин, ще 100 Ae. aegypti личинки були введені в кожен резервуар. Кількість вижилих личинок комарів у кожному резервуарі підраховували з інтервалом у 1 годину до 48 годин з незначними змінами в методології, описаній Сінгхом та ін. [25] та Шад та Ендрю [1]. Весь експеримент повторювали п’ять разів, щоб зберегти точність висновків.

3.2. Вплив стадії німфи німфи бабок на хижацьку ефективність

Види бабок з найвищим рівнем хижацтва німфів були визнані з вищенаведеного експерименту (тобто., Anax indicus). Загальну довжину нірфи бабки, виміряну до найближчого міліметра за допомогою лінійки, використовували для класифікації стадії німфи на три класи як (а) початкову стадію (10-20 мм загальної довжини тіла у випадку Ана індікус); (b) середня стадія (25-35 мм) і (c) стадія дозрівання (35-45 мм). Вищевказана установка була повторена п’ять разів з кожною з трьох різних за розміром тіла нірфів бабок виду, які виявили найвищу ефективність хижацтва.

3.3. Інтерпретація даних та статистичний аналіз

Швидкість хижацтва розраховували як відрахування продукту личинок комарів, що залишилися, від початкових/раніше вижилих личинок. Швидкість хижацтва кожної досліджуваної бабки-німфи Ae. aegypti личинки були занесені в робочий аркуш Microsoft Excel. Значущість загальної та погодинної швидкості хижацтва бабок-німф статистично оцінювали за допомогою Загальної лінійної моделі (GLM) з подальшим парним порівнянням Тукі у SPSS (версія 23). Кластерний аналіз Брей Кертіса на основі схожості з подальшим Аналізом подібностей (ANOSIM) (тобто непараметричний аналог MANOVA) був використаний для виявлення загального стану кластеризації досліджуваних бабок з точки зору їх хижацьких моделей за допомогою процедур Плімута в багатовимірних екологічних дослідженнях версія 6 (PRIMER 6) програмного забезпечення [26].

4. Результати

4.1. Хижацька ефективність німф різних видів бабок на личинках Aedes aegypti

Результати парного порівняння Тукі (post hoc аналіз) чітко вказували на те, що хижацька ефективність P. flavescens і Г. дравіда не суттєво відрізнялися (p> 0,05 при рівні 95% довіри), що суттєво відрізнялося від рівня Ана Індікус (p Рисунок 3

4.2. Ефективність хижацтва різних стадій німфи Anax indicus на личинках Aedes aegypti

Ана індікус німфи повідомили про найвищу хижацьку ефективність на Ae. aegypti личинки з поточного дослідження. Тому в поточному дослідженні досліджено вплив розміру тіла личинки на Ана індікус (з точки зору довжини тіла) на хижацьку ефективність. Середня кількість Ae. aegypti личинки, спожиті Ана індікус значно варіювали залежно від розміру тіла личинок бабок (с Розмір тіла/категорії зрілостіСередня кількість Aedes aegypti личинки, спожиті Anax indicusЗагальна кількість личинок, спожитих протягом 24 годинСередня кількість личинок, спожитих протягом 1 години Великий/Початковий
(35-45 мм)214,00 ± 13,20

4.3. Часові варіації хижацтва Anax indicus на Ae. aegypti Личинки

4.3.1. Щоденні зміни хижацтва

Через те, що він є найкращим виконавцем з найвищими показниками хижацтва, добові зміни хижацької дії Ана індікус на Ae. aegypti комарів були додатково досліджені. Як позначено на малюнку 4, швидкість хижацтва Ана індікус були майже однакові як вдень (з 6:00 до 18:00), так і вночі (з 18:00 до 6:00 ранку). Однак слід підкреслити, що було проведено лише обмежену кількість повторень (n = 5), що може бути недостатнім для прийняття обґрунтованого висновку щодо часових коливань хижацьких ставок Ана індікус, в перерахунку на день і ніч.

4.4. Погодинна тимчасова варіація Anax indicus Личинка хижацтва на Aedes aegypti Личинка

У разі щогодинних часових коливань темпів хижацтва Ана індікус німфи на личинках Ae. aegypti, два помірні піки хижацтва спостерігались на світанку (з 6.00 до 9.00) та в сутінках (з 15.00 до 18.00). Серед них найвищий рівень хижацтва спостерігався у сутінках. Однак, як вказує малюнок 5, суттєвих коливань у погодинних показниках хижацтва не зафіксовано Ae. aegypti споживання личинок за Ана індікус.

5. Обговорення

Будучи однією з основних загроз для здоров’я в Шрі-Ланці, денге викликає серйозні циклічні епідемії в галузі охорони здоров’я країни. Сучасні методи боротьби з векторами, які головним чином зосереджені на хімічному контролі векторів, з меншим акцентом на управління векторами, залученими спільнотою, мають обмежений успіх у боротьбі із спалахами денги [27]. Тому оцінка ефективності нових методів боротьби з векторами, таких як використання різних біологічних засобів боротьби, є суттєвою для вирішення гострої проблеми денге [1, 20, 25]. Бабки показали багатообіцяючі результати в цьому аспекті і використовувались у багатьох сусідніх округах зі схожими екологічними та соціально-економічними умовами [12, 13, 25].

І те, і інше Г. дравіда і Ана індікус є членами Aeshnidae, яких зазвичай називають соколами. Г. дравіда розподілений по низькій місцевості, охоплюючи як вологі, так і сухі зони навколо боліт і резервуарів з бур’янистою рослинністю, і часто зустрічається всередині будинків, оскільки його приваблює світло вночі. Дорослі з них залишаються переважно активними у сутінках [28]. Отже, цей вид має великий потенціал для хижацтва як на личинках, так і на дорослих особинах Едіс комарі, на стадії його личинок і дорослих у зменшенні Едіс популяцій.

В поточному дослідженні використано 4-ту стадію Ae. aegypti личинки комарів для всіх експериментів з хижацтвом, оскільки вона залишається личинковою стадією з найбільшими розмірами тіла. Однак попереднє дослідження повідомляло, що хижацький вплив Bradinopyga geminata на Ae. aegypti личинки були вищими у личинок 1-ї стадії, ніж у інших пізніх, можливо, через менший розмір тіла [12]. Ще одне подібне дослідження показало, що норма годівлі Б. забруднюють на водних стадіях Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus, і Ae. aegypti також продемонстрував подібну тенденцію, де максимум хижацтва спостерігався у личинок 1-ї стадії [25].

За даними Кордови-Агілар та Лі [13], як менші, так і більші бабки-німфи передують більшій жертві при великій щільності здобичі. Як показують їхні висновки, Orthemis ferruginea (fabricius) личинки бабок (Родина: Libellulidae) передують 4-му періоду Ae. aegypti комарі, ніж 1-й вік та лялечки, особливо хижаки меншого розміру. Незважаючи на те, що четвертий вік не більший за лялечок, їх форма може змусити їх здаватися більшими для хижаків. Отже, на вибір хижаки бабки може впливати форма та рух, а також розмір здобичі. Комарі четвертого віку більш активні, а також більші, ніж інші три рівні личинок комарів. Тільки менші хижаки харчуються значно більше найбільшою здобиччю при однаковій щільності здобичі різного розміру, тоді як більші нірфі бабок не надавали переваги розміру [13]. Це може пояснюватися високою потребою в енергії менших за розміром личинок бабок через їх прагнення завершити стадії розвитку в життєвому циклі.

Однак у поточному дослідженні, Ана індікус при відносно більшому розмірі тіла (35-45 мм) вказували на найвищу хижацькість 214,00 + 13,20 як загальне споживання личинок. Кілька досліджень, що оцінювали хижацтво Ортеміда spp. показали, що бабки-бабки з великими розмірами тіла передують личинкам комарів, не віддаючи перевагу незрілим стадіям комарів [31, 32]. Далі, висновки Чаттерджі та ін. погодитись із нинішніми висновками, виділивши, що німфи малого розміру Brachytron pratense не були зацікавлені полювати на четверту стадію личинок комарів у лабораторії без тривалого голодування [33]. Отже, коливання розмірів зере німф бабок, які трапляються із збільшенням віку, могли призвести до високого видобування личинок 4-го періоду німфами більшого розміру в тілі.

Добова варіація хижацтва Ана індікус личинок бабок на Ae. aegypti личинки суттєво не відрізнялися в рамках цього дослідження. Результати поточного дослідження відповідають висновкам Кордови-Агілара та Лі, які також показали, що немає значної різниці в хижацтві в темних та світлих умовах Orthemis ferruginea проти Ae. aegypti личинки [13]. Цікаво, що в цьому дослідженні винищування Ана індікус було трохи вище на світанку та в сутінках, тоді як хижацтво було нижчим у середині дня. Далі, найвищий показник хижацтва спостерігався у сутінках, незалежно від відсутності значних коливань у погодинних показниках хижацтва. Подібні висновки повідомляли Венкатеш та Тягі, відповідно процентне споживання Ae. aegypti личинки мимо Брадинопига гемінат залишився без помітних добових змін [12]. Більше того, відносно високий рівень хижацтва личинок комарів у темряві (який не був статистично значущим) свідчив про Трамея spp. [31]. З іншого боку, попереднє дослідження, проведене Mandal та ін. висвітлив значну добову зміну Cx. quinquefasciatus хижацтво, що вказує на нижчий рівень хижацтва вночі [19].

Як правило, бабки-німфи, що належать до роду Анакс є високопристосованими поверхневими живильниками, і їх добовий ритм годування пояснюється різними фактами в літературі [24]. Встановлено, що частота мерехтіння у відповідь на них пов'язана з інтенсивністю світла, тоді як середнє критичне освітлення поступово зміщується у бік вищих інтенсивностей при нижчих температурах навколишнього середовища [28]. Отже, можна очікувати, що прогресивне збільшення значущості очей вплине на добовий ритм годівлі, незалежно від статистично незначущих показників хижацтва. Далі рід Анакс відомо, що це вказує на циркадний ритм рухової активності, який залучається взаємообмінним циклом світло-темрява. Як повідомляється, вони вночі повільно пересуваються дном, замість того, щоб рухатися реактивним рухом у денний час, що дозволяє їм мати більше шансів знайти личинок комарів як здобич [24].