Межі в мікробіології

Мікробіологія систем

Редаговано
Яньхун Лю

Каліфорнійський університет, Девіс, США

Переглянуто
Сі Ма

Китайський сільськогосподарський університет, Китай

ЦЯНЧЧАО ЖАО

Університет Арканзасу, США

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

дієтичним

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Коледж харчових наук та технологій, Нанкінський сільськогосподарський університет, Ключова лабораторія переробки м'ясних продуктів, Міністерство сільського господарства та сільських справ, Спільний інноваційний центр провінції Цзянсу з виробництва та переробки м'яса, контролю якості та безпеки, Нанкін, Китай
  • 2 Школа харчових наук, Нанкінський університет Сяочжуан, Нанкін, Китай

Вступ

М’ясо та молочні продукти є основними дієтичними джерелами білків тваринного походження для харчування людей, які містять велику кількість та збалансовану пропорцію амінокислот щодо тканин людини (Li et al., 2011; FAO, 2013). Отже, адекватне споживання такої їжі має важливе значення для оптимального росту, розвитку та здоров’я людини (Wu, 2016). З 1990 року споживання курятини в розвинутих країнах зросло на 70%, і воно стає одним із найбільш споживаних видів м'яса, що свідчить про його все більший вплив на здоров'я людини. Казеїн є особливим завдяки високому вмісту амінокислот з розгалуженим ланцюгом (BCAA) (Rafiq et al., 2016) і має потенціал зменшити збільшення маси тіла та ожиріння, спричинене дієтою (Lillefosse et al., 2013; Liisberg et al., 2016).

Хоча курячий білок та казеїн були оцінені як високоякісні білки, короткочасне втручання нашої групи продемонструвало, що два дієтичні білки привели до різних фізіологічних та печінкових транскриптомних змін у молодих щурів (Song et al., 2016b). Ряд досліджень показав, що існує тісний зв'язок між ожирінням, дієтою з високим вмістом жиру та мікробіотою кишечника (Martinez et al., 2017). Однак кілька довготривалих досліджень на тваринах також показали, що казеїн або ХОЗЛ змінювались за своїм ефектом на розвиток ожиріння у мишей з високим вмістом жиру, яких годували мишами (Liisberg et al., 2016), і мікробіоти кишечника у звичайних жирових щурів, що харчувались жиром (Zhu et al., 2015), що вказує на вирішальний вплив джерел білка. Нещодавно було показано, що мікробіота кишечника відіграє вирішальну роль у здоров’ї людини, впливаючи на фізіологію, енергетичний гомеостаз або імунну систему (Rooks and Garrett, 2016; Smidt et al., 2016; Gomes et al., 2018). Вживання дієти може визначити різноманітність та метаболічні результати мікробної спільноти (Zmora et al., 2019). Взяті разом, пов’язані з дієтами зміни мікробіоти кишечника можуть бути причинно пов’язані з метаболізмом господаря. Однак асоціації між мікробіотою кишечника та господарем у відповідь на харчові білки менш досліджені. Крім того, більшість пов’язаних аналізів мікробіоти кишечника проводились на основі секвенування рРНК 16s, що може спричинити упередження.

У цьому дослідженні ми годували молодих щурів казеїном або CHPD протягом 7 днів і характеризували склад мікробіоти сліпої кишки та експресію генів у тканинах сліпої кишки за допомогою метагеноміки дробовика та секвенування транскриптомів. Обговорювались асоціації між кишковими бактеріями, експресія генів у тканині сліпої кишки та фізіологічні реакції.

Матеріали і методи

Дієти

Білкові дієти були підготовлені компанією Jiangsu Xietong, Inc. відповідно до рецептури AIN-93G (Reeves et al., 1993). Казеїн або курячий білок були включені в дієти. Щоб забезпечити узгодженість дієт, більшість дієтичних інгредієнтів було придбано у Dyets Inc. (Віфлеєм, Пенсильванія, США). Курячий білок готували наступним чином. Курка pectoralis major М'язи готували на водяній бані з температурою 72 ° C до температури 70 ° C у центрі. Приготовлене м’ясо охолодили і подрібнили. Жир видаляли у суміші дихлорметану та метанолу (1: 2, v: v). Потім куряче м’ясо в порошку пропускали через 25 сит. Порошок складається з білків (> 90%) та невеликої кількості мінеральних та інших мікроелементів. Детальна інформація про дієтичну формулу була перелічена в додатковій таблиці S1.

Годування тварин

Експеримент на тваринах був раніше описаний (Song et al., 2016b), і всі експериментальні протоколи були схвалені Комітетом з догляду за тваринами Нанкінського сільськогосподарського університету. Коротше кажучи, після 1-тижневого періоду адаптації, 4-тижневих самців щурів Спрег-Доулі годували або на основі казеїну, або ХОЗЛ (10 щурів у кожній групі). Через 7 днів годування щурів знеболювали ефірною інгаляцією. Вміст клітин та тканини отримували та заморожували окремо у рідкому азоті. Три з 10 зразків у кожній групі були випадковим чином відібрані для метагеномного секвенування (вміст сліпої кишки) та аналізу транскриптома (тканини сліпої кишки).

Метагеномічне секвенування

Вилучення та секвенування ДНК

Геномну ДНК витягували згідно з протоколами Zoetendal et al. (2006). Побудова бібліотеки ДНК виконувалась відповідно до вказівок виробника (Illumina Hiseq 2000). Парні кінцеві бібліотеки ДНК були побудовані та послідовно розміщені на 100 bp читання з кожного кінця під платформою Illumina Hiseq2000 за стандартними конвеєрами.

Обробка даних

Фільтрація даних проводилась із використанням власних сценаріїв згідно з конвеєром MOCAT (Kultima et al., 2012). Забруднення адаптера, низькоякісні зчитування та зчитування, що забруднюють хост, були видалені з необроблених наборів зчитування послідовності. Нарешті, були отримані високоякісні дані для метагеномічного аналізу.

Видовий склад та аналіз чисельності

Відомі послідовності бактерій витягували з бази даних NT, а потім відфільтровані зчитування наносили на ці послідовності SOAPaligner (версія 2.21) (Li et al., 2009). Картографувані читання класифікувались на різних таксономічних рівнях (включаючи тип, клас, порядок, сім’ю, рід та види), а відповідне кількість було підсумовано. Для диференціального аналізу бактерій між двома дієтичними групами застосовували негативний біноміальний тест на різницю розподілу (DEseq2, пакет R).

Асамблея та прогнозування генів

Відфільтровані дані були зібрані SOAPdenovo (Li et al., 2008) (Версія 1.06 1), а результати збірки оптимізовані за допомогою власної програми (BGI, Шеньчжень). Програмне забезпечення MetaGeneMark (версія 2.10, параметри за замовчуванням 2) було використано для прогнозування відкритих кадрів зчитування (ORF) на основі результатів складання (Zhu et al., 2010). ORF з усіх зразків об'єднували без надмірності (обробляли програмним забезпеченням cd-hit, 4.6.1 3) (Li and Godzik, 2006), щоб отримати генний каталог. Послідовне читання було анотовано за допомогою призначення груп KEGG Orthology (версія 59). Пакет DESeq2 R був застосований для диференціального аналізу ортології KEGG (KO) на основі даних про зчитування даних між двома дієтичними групами. Аналіз збагачення наборів генів (GSEA) застосовували для оцінки змін у експресії генів, пов’язаних з біологічними процесами (Subramanian et al., 2005). Набори генів були отримані з куратора експертів KEGG шляху 4 .

Послідовність транскриптомів

Загальну РНК екстрагували з тканини сліпої кишки за допомогою універсального набору для екстракції РНК Takara MiniBEST (Takara, Кусацу, Японія). Деградацію та забруднення РНК контролювали на 1% агарозних гелях. Чистоту РНК перевіряли за допомогою спектрофотометра NanoPhotometer ® (IMPLEN, Лос-Анджелес, Каліфорнія, США). Концентрацію РНК вимірювали за допомогою набору для аналізу РНК Qubit ® у флуорометрі Qubit ® 2.0 (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія, США). Цілісність РНК оцінювали за допомогою набору для аналізу РНК Nano 6000 системи Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США).

Підготовка бібліотеки до секвенування транскриптомів

Кластеризація та секвенування

Кластеризація кодованих з індексом зразків проводилася на системі генерації кластерів cBot за допомогою TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Іллумія, США) згідно з інструкціями виробника. Після генерації кластера підготовка бібліотеки була послідовно розподілена на платформі Illumina Hiseq (Illumina, Сполучені Штати Америки) та генеровано спарені зчитування 125 bp/150 bp.

Контроль якості

Неопрацьовані дані формату fastq спочатку оброблялись за допомогою власних скриптів perl. Чисті зчитування були отримані шляхом видалення зчитувань, що містять адаптер, ploy-N та низькоякісні зчитування з необроблених даних. Розраховували вміст Q20, Q30 та GC у чистих даних. Весь подальший аналіз базувався на чистих даних.

Читає зіставлення з еталонним геномом

Довідкові файли анотацій геному та моделі генів були завантажені безпосередньо з веб-сайту геному. Індекс еталонного геному був побудований з використанням Bowtie v2.2.3 (Langmead and Salzberg, 2012), а парні чисті читання були вирівняні до еталонного геному за допомогою TopHat v2.0.12 (Trapnell et al., 2009).

Аналіз диференціальних виразів

Аналіз диференціальної експресії проводили на основі моделі негативного біноміального розподілу з використанням пакету DESeq2 R (1.24.0). В результаті P значення коригувались за допомогою підходу Бенджаміні-Хохберга для контролю рівня помилкових відкриттів (FDR). Гени з коригуванням P значення TM RT Master Mix (Perfect Real Time) (Takara, Японія). Кількісну ПЛР у реальному часі проводили за допомогою ПЛР в реальному часі Applied Biosystems TM QuantStudio TM 6 Flex (Life Technologies, Уолтем, Массачусетс, США). Аналіз даних проводився за методом 2 –ΔΔCt (Livak and Schmittgen, 2001). Групу, що годувала казеїн, встановлювали як контрольну групу. Праймери для кожного конкретного гена були перераховані в додатковій таблиці S2.

Кореляційний аналіз експресії мікробіоти та кишківника в кишці

Кореляційний аналіз проводили між мікробіотою кишечника та експресією гена господаря за допомогою пакету mixOmics R (версія 6.1.1 5) (Rohart et al., 2017). Коефіцієнти кореляції були розраховані між усіма видами бактерій та верхніми 250 диференційовано експресованими генами.

Результати

Короткотерміновий вплив дієтичного білка на мікробіоту цекул

ДНК бактерій витягували із сліпої кишки вмісту щурів, яких годували казеїном та CHPD протягом 7 днів. ДНК секвенували за допомогою секвенування метагеномів, що дало 18 гігабаз (Гб) високоякісних даних із середнім значенням 3 Гб на зразок (Додаткова таблиця S3). Аналіз розподілу частоти K-mer показав, що дані послідовності були надійними (додатковий малюнок S1).

Великі відмінності спостерігались у складі мікробіоти кишечника у сліпій кишці щурів, які годувались ІХС та ХГН. На рівні статусу, Фірма і Бактероїдети в середньому становив 96,3 та 80,3% мікробіоти сліпої кишки у групах ІХС та ХОЗЛ (рис. 1А). Принциповий аналіз компонентів вказує на відмінність складу мікробіоти кишечника у щурів, що харчуються САПР, від складу щурів, що харчуються CHPD (рис.

Фігура 1. Мікробіота сліпої кишки щурів, яких годували дієтою на основі казеїну та курячого білка. (A) Мікробний склад сліпої кишки на рівні типу. (B) Діаграма розкиду PCA на видовому рівні. (C) Диференціальні бактерії на рівні роду (P Ключові слова: казеїн, курка, Lactococcus lactis, AdipoQ, Irs1

Цитування: Zhao F, Song S, Ma Y, Xu X, Zhou G and Li C (2019) Короткочасне годування дієтичним казеїном збільшує кількість Lactococcus lactis та підвищує рівень експресії генів із запобіганням ожирінню в сліпій кишці молодих щурів порівняно з харчовим курячим білком. Спереду. Мікробіол. 10: 2411. doi: 10.3389/fmicb.2019.02411

Отримано: 01 червня 2019 р .; Прийнято: 07 жовтня 2019 р .;
Опубліковано: 25 жовтня 2019.

Янхонг Лю, Каліфорнійський університет, Девіс, США

Цзянчао Чжао, Університет Арканзасу, США
Сі Ма, Китайський сільськогосподарський університет (CAU), Китай