Межі у харчуванні

Харчові та харчові технології

Редаговано
Антоніо М. Перес

Політехнічний інститут Браганса (IPB), Португалія

Переглянуто
Стефано Сфорца

Університет Парми, Італія

Арміндо Мело

Фармацевтичний факультет Університету Порту, Португалія

Джоост Гау

Nutricia Research (Нідерланди), Нідерланди

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

дієтичної

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Національна дослідницька рада (CNR), Інститут харчових наук, Авелліно, Італія
  • 2 Кафедра поступальної медичної науки, Неаполітанський університет "Федеріко II", Неаполь, Італія
  • 3 CEINGE Advanced Biotechnologies, Неаполітанський університет “Федеріко II”, Неаполь, Італія
  • 4 Департамент сільського господарства, Парко Гуссоне, Неаполітанський університет “Федеріко II”, Портічі, Італія
  • 5 Європейська лабораторія з вивчення харчових захворювань, Неаполітанський університет "Федеріко II", Неаполь, Італія
  • 6 Робоча група з вивчення мікробіомів, Університет “Федеріко II”, Неаполь, Італія

Вступ

Грудне молоко містить антигенно активні харчові алергени, що виникають з раціону матері (1). Це твердження в основному ґрунтується на імунохімічних даних та клінічних дослідженнях, проведених у 1980-90-ті роки (4–6). У ті роки було чітко встановлено, що харчові алергени, отримані з раціону матері, можуть викликати клінічні прояви побічних реакцій у чутливих новонароджених, що перебувають на грудному вигодовуванні, із частотою захворюваності 0,5% (7–10). Кілька досліджень зафіксували наявність у грудному молоці змінних кількостей інтактних харчових алергенів, включаючи овальбумін (11), гліадин (12), арахіс (2, 13) та білки коров’ячого молока (10). Повідомляється, що харчові алергени в жіночому молоці змінюються в дуже широкому діапазоні концентрацій від трохи вище 0,1 до> 1000 нг/мл (3), але низькі рівні ppb (нг/мл), мабуть, найбільш реалістичні показники (14).

Пошук алергенів на коров’ячому молоці в грудному молоці був предметом гарячих досліджень. Людський та бичачий β-казеїн, αs1-казеїн та α-лактальбумін мають середній та високий ступінь гомології послідовності (53, 31 та 73% гомології відповідно) і, отже, певну перехресну реакцію імунітету. Отже, β-лактоглобулін (β-Lg), який не експресується людиною, часто спостерігався як маркер коров’ячого молока. Згідно з імунохімічними даними, на виведення дієтичних харчових алергенів у грудне молоко, як правило, впливає помітна мінлива та внутрішньо-індивідуальна мінливість (11, 14–16). З особливим занепокоєнням щодо алергенів на коров’ячому молоці екзогенний β-Lg був виявлений лише у обмеженій кількості зразків молока матері, і його наявність не пов’язана з атопічними чи неатопічними станами (15). У лонгітюдному дослідженні, проведеному протягом усього періоду лактації, 93 з 232 (тобто 40%) зразки грудного молока, отримані від 25 здорових донорів, містили помітну кількість дієтичного β-Lg (16). Лише у двох матерів виявляли β-Lg у всіх зразках молока, тоді як молоко шести матерів не містило його жодного разу. Нещодавно Матангкасомбут та ін. (17) повідомили, що дієтичний β-Lg зберігався в жіночому молоці навіть до 7 днів після споживання коров'ячого молока.

Шокер та ін. (23) використав двовимірний електрофорез/вестерн-блот та MS для дослідження проникнення негідролізованого Ara h 2 та інших арахісових алергенів у грудне молоко. Цікаво, що вони також аналізували зразки людського молока за допомогою конкурентного ІФА, щоб кількісно визначити можливі стійкі до травлення пептиди, отримані з арахісових білків.

Вперше ми використали РС для виявлення пептидів, що виникають в результаті перетравлення бичачого казеїну та білків сироватки, що виділяються в грудне молоко годуючих донорів після перорального прийому коров’ячого молока (24). Зокрема, фрагменти β-Lg та αs1-казеїну великої рогатої худоби були виявлені у 12% -ній розчинній у трихлороцтовій (TCA) фракції двох та одного з шести зразків грудного молока відповідно. На противагу цьому, пептиди β-Lg, ідентифіковані за допомогою MS з високою роздільною здатністю/чутливістю, уникли конкурентного тесту ELISA, проведеного на нефракціонованому молоці, припускаючи, що вони можуть виникати з дуже низьким вмістом. Як і очікувалося, у контрольних зразках молока, отриманих у шести жінок, що годують, що дотримуються суворої дієти, що не містить молока та щоденників, не було пептидів, отриманих з коров'ячого молока. Відсутність інтактного β-Lg у виявлених кількостях у будь-яких зразках грудного молока було підтверджено електрофорезом додецилсульфату натрію та поліакриламідного гелю (SDS-PAGE) та вестерн-блот-аналізом 12% -ної нерозчинної в ТСА білкової гранули. Зовсім недавно Чжу на співавт. (25) отримали висококурований перелік нелюдських пептидів у жіночому молоці на основі даних MS, і пептиди, отримані з коров’ячого молока, були найбільш представленими видами.

У цьому дослідженні ми прагнули відстежувати можливу внутрішньо-індивідуальну мінливість дієтичних пептидів коров’ячого молока в жіночому молоці. З цією метою ми націлили пептиди, отримані з бичачого молока, в грудному молоці, відібрані у одного донора до і після відповідних пероральних навантажень коров’ячого молока в різні дні. Крім того, грудне молоко відбирали у тієї самої годуючої матері протягом 6 годин (п’ять часових точок) після вживання коров’ячого молока. Янссен Дуйгхуйзен та ін. (26) елегантно підкреслив можливість того, що пептиди, отримані з їжі різної довжини, можуть потрапляти під дію ендогенних антитіл у рідинах організму. Таким чином, на додаток до 12% -ної розчинної в ТСА фракції, ми проаналізували триптичні дайджести нерозчинних білкових гранул за допомогою ВЕРХ-МС/МС.

Матеріали і методи

Діотитрейтол (DTT), йодоацетамід (IAA), гуанідин, трифтороцтова кислота (TFA), бікарбонат амонію (Ambic), трис-основа, EDTA та інші хімічні речовини придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Мічиган, США). Розчинники марки ВЕРХ-МС отримували від Carlo Erba (Мілан, Італія). Ізолят сироваткового білка великої рогатої худоби, що використовується для приготування позитивних контролів, був отриманий від Fonterra Dairy Co. через Інститут Ріддетта, Нова Зеландія.

Відбір проб

Всього 18 проб грудного молока (5 мл) було отримано за допомогою молоковідсмоктувача, оснащеного пластиковими одноразовими насосними установками. Зразки були зібрані протягом другого та третього місяця лактації після пологів у неатопічного здорового донора (28 років), який доставив у термін. Зразки грудного молока (

5 мл) збирали протягом різних днів між 2 та 3 годинами після 200-мл перорального завантаження пастеризованого бичачого молока. Молоко зціджували в пластикові стерильні пробірки, змішували з інгібітором серин-протеази (Pefabloc ®, Sigma, Сент-Луїс, Мічиган, США, кінцева концентрація 1 мМ) і негайно заморожували при -20 ° C для запобігання небажаному гідролізу.

Первинний скринінг проводили на зразках грудного молока, відібраних у донора протягом 5 різних днів. Ці зразки були позначені як D1, D2, D3, D4 та D5. Мама, що годує, дотримувалася суворої дієти, в якій не було коров’ячого молока та молочних продуктів протягом принаймні 1 тижня. Загалом було відібрано та проаналізовано 10 зразків шляхом збору грудного молока до і після годування дитини кожного дня відбору проб. Зразки серії D проводились у двох примірниках. Три контрольні зразки молока (базові лінії) були зібрані до того, як матері дали коров'яче молоко.

Після оцінки присутності пептидів, отриманих з бичачого молока, в грудному молоці, від тієї ж матері були отримані додаткові зразки. У цьому випадку грудне молоко збирали протягом 6-годинного періоду з інтервалами часу (1, 2, 3, 4 та 6 год) після перорального завантаження бичачого молока. Ці зразки розроблені як Т0 (базовий рівень), Т1 (1 год), Т2 (2 год), Т3 (3 год), Т4 (4 год) та Т5 (6 год) та аналізовані за допомогою ВЕРХ-МС/МС в триразовий. Кваліфікований оператор кафедри трансляційної медицини Неаполітанського університету "Федеріко II" (Італія) контролював введення бичачого молока, збір зразків та маркування кодів. До збору зразків молока від матері була отримана письмова інформована згода.

Екстракція пептидів

Аліквоти зразків грудного молока відбирали шляхом центрифугування (3000 × g протягом 15 хв при 4 ° C), а верхній жировий шар видаляли шпателем (що повторювали двічі). Білки знежиреного молока осаджували при 4 ° C з кінцевою концентрацією 12% (мас./Об.) Трихлороцтової кислоти (TCA) і гранулювали центрифугуванням (4500 × g протягом 30 хв при 4 ° C). 12% розчинних у ТСА пептидів (250 мкл) екстрагували у твердофазній фазі із використанням спінових колон з зворотно-фазою C18 (Pierce Biotechnology, Рокфорд, Іллінойс, США), широко промивали 0,1% трифтороцтовою кислотою (TFA) і елюювали 70% ацетонітрилом. (AcN), що містить 0,1% TFA. AcN випаровували в системі випарника SpeedVac ™, і пептиди остаточно ліофілізували.

Триптичний гідроліз білкової гранули

Для видалення ТСА із залишкової гранули осад ресуспендували в холодному ацетоні (-20 ° C) і тричі центрифугували при 4500 × g протягом 30 хв при 4 ° C. Нарешті, 5 мг висушеного білкового порошку розчиняли в 1 мл денатуруючого/відновного буфера (6 М гуанідину HCl, 0,3 М Tris, 1 мМ EDTA, 10 мМ DTT, pH 8,0) та інкубували при 56 ° C протягом 1 год. . Потім цистеїни алкілували ІАА (кінцева концентрація 55 мМ) протягом 40 хв при кімнатній температурі в темряві. DTT у стехіометричній кількості використовували для гасіння надлишку IAA. Цис-алкільовані білки (аліквоти 50 мкл) розбавляли в 10 разів 25 мМ бікарбонатом амонію (AMBIC) при рН 7,8 і розщеплювали протягом ночі при 37 ° С трипсином при співвідношенні ферменту до субстрату 1:50 (мас: ш). Отримані пептиди очищали за допомогою спін-колон з зворотно-фазовою С18 і ліофілізували до аналізу ВЕРХ-МС/МС.

Конкурентний ІФА для фрагментів β-Lg

Пошук у базі даних та ідентифікація пептидів

Вихідні дані LC-MS/MS аналізували за допомогою інструменту Andromeda програмного пакету MaxQuant (версія 1.6.2.10). Пошуки були таксономічно обмежені Homo sapiens і Бос Телець у базі даних Uniprot (оновлено в листопаді 2017 року). Згодом пошуки уточнили за допомогою вручну побудованої бази даних про білки, що містить 30 найпоширеніших генних продуктів коров’ячого молока, виведені з досліджень на основі протеомів (27, 28). Для аналізу 12% ТЦА-розчинних пептидів умови пошуку включали неспецифічне розщеплення, відсутність статичної модифікації, окислення Met, піроглутамінову кислоту на N-кінці Gln та фосфорилювання Ser/Thr як змінних модифікацій.

Для аналізу білкових гранул в якості протеолітичного ферменту з двома пропущеними розщепленнями був обраний трипсин, а в якості статичної модифікації був включений карбамідометил-цистеїн. Аналіз пептидів з гранул також повторювали в умовах неспецифічного розщеплення з метою виявлення можливих пептидів, отриманих з бичачого молока, що виникають в результаті травлення матері та пов'язані з антитілами до грудного молока. У всіх випадках значення масового допуску становило 5 ppm для іона попередника та 10 ppm для фрагментів MS/MS. Збіги пептидного спектра (PSM) відфільтровували, використовуючи підхід до бази даних цільових приманок, із значенням e 0,01, коефіцієнт помилкового виявлення на рівні пептиду (FDR), що відповідає 99% балу довіри. Оскільки між послідовностями білка молока людини та бичачого молока існує значне перекриття, необхідно було уточнити дані, визначивши пептиди, які відповідають обом протеомам. Пептиди, які точно відповідали послідовності великої рогатої худоби та людини, були вилучені з остаточного списку результатів. Лише пептиди, що походять із порівняно великих білків бичачого молока, були включені до списку ідентифікованих пептидів великої рогатої худоби.

Результати

Через інтенсивну активність ендогенних протеаз людське молоко по суті багате на олігопептиди (29), які заважають виявленню на основі РС слідових кількостей можливих чужорідних пептидів, що виникають з раціону матері. Незважаючи на те, що пошук пептидів, отриманих з коров'ячого молока, практично обмежений відносно невеликою кількістю рясних білків (казеїну та основних білків сироватки), не існує можливості передбачити, які пептиди можуть виводитися в грудне молоко через значну відсутність специфічності розщеплення для деградації білка під час до- та пост-абсорбційної фаз в організмі матері. Таким чином, аналітична складність системи вимагає поєднання “глибокої” та “нецільової” пептидоміки, яку можна вирішити лише за допомогою сучасних передових пептидомічних підходів. Така складність також забезпечить правдоподібну причину того, чому дотепер не робилося чи взагалі не робилося спроб виявити пептиди, що походять від харчових алергенів, у жіночому молоці.

Дієтичні пептиди коров’ячого молока в грудному молоці

Малюнок 3. Зразковий робочий процес для ідентифікації пептиду β-казеїну f (81–92) у зразку грудного молока Т2. (A) ВЕРХ MS/MS TIC хроматограма 12% розчинних у ТСА пептидів; (B) Спектр MS1 при часі утримання (RT) 109,0–109,2 хв. Врізка на панелі B показує збільшений вигляд, що містить сигнал m/z 660,88 (*); (C) Спектр MS/MS сигналу m/z 660,88 із присвоєнням фрагментів сигналу β-казеїну f (81–92). Пептид дієтичного походження є незначним сигналом MS, що міститься в хроматографічних піках з дуже низьким вмістом, що вказує на його мізерну відносну кількість у грудному молоці.

Отже, сигнали пептидів, отриманих з молока, були принаймні на 3,5–4 порядки (5 × 10 3 -10 4-кратного) менш інтенсивними, ніж у найбільш поширених ендогенних пептидів грудного молока (інтенсивність у 1,7–2,9 × 10 10 діапазону), що серйозно кидає виклик динамічному діапазону методу MS.

Ці результати продемонстрували, що пептиди, отримані з материнської дієти, мали дуже низьку кількість у порівнянні з ендогенними пептидами грудного молока, які в свою чергу представляють лише частку вмісту білка/поліпептиду в жіночому молоці.

Кількісні показники цього дослідження представляють загальну оцінку кількості екзогенних пептидів. Точної відносної кількісної оцінки серед зразків Т-серії можна досягти, позначаючи пептиди мітками зі стабільними ізотопами, що генерують фрагменти репортерів із низькою масою (наприклад, метод iTRAQ). Абсолютна кількісна оцінка дієтичних пептидів потребує спеціального дослідження з відповідними стандартами, і його слід проводити за зразком через мінливість складу поліпептидної фракції людського молока (25). Незважаючи на традиційну класифікацію дієтичних білків як «швидких» (сироваткові білки) та «повільних» (казеїни) на основі їх відносної швидкості перетравлення та поглинання (34), ранні пептиди виникали як з казеїнів, так і з білків сироватки. Це свідчить про те, що гідролітичні фрагменти двох сімейств білків можуть досить швидко перетравлюватися, розподілятися та виводитися в грудне молоко.

Точковий аналіз

Пептиди, що походять від β-Lg, у збагаченій та очищеній 12% -ній розчинній у ТСА пептидній фракції зразків грудного молока серії D були націлені на точковий аналіз. Пептидні екстракти всіх зразків були чітко розпізнані анти-β-Lg антитілом, подібно до хімотриптичного дайджесту білків сироватки великої рогатої худоби, що використовується як позитивний контроль (рис. 4). На відміну від цього, вихідні зразки грудного молока, зібрані до перорального завантаження коров’ячого молока, не були імунореактивними, тим самим виключаючи можливу перехресну реакцію з пептидами, що походять з ендогенних білків молока. Інтенсивність імунореактивних плям неможливо корелювати з кількістю та інтенсивністю іонів пептидів, похідних β-Lg, виявлених ВЕРХ-МС/МС, оскільки можливі імунореактивні поліпептиди β-Lg можуть уникнути аналізу МС.

Малюнок 4. Точ-блот-виявлення імунореактивних β-Lg-пептидів у 12% -ній розчинній у ТСА фракції зразків грудного молока серії D. Базовими зразками (BL) були екстракти пептидів з грудного молока, отримані до перорального навантаження коров’ячого молока. H-β-Lg був хімотриптичним дайджестом β-Lg, що використовувався як позитивний контроль.

Конкурентний ІФА

Намагаючись кількісно визначити β-Lg пептиди, ми проаналізували всі зразки грудного молока за допомогою конкурентного тесту ELISA, який був спеціально розроблений для визначення як нативних β-Lg, так і похідних пептидів у матрицях обробленої їжі. Стандартні розчини β-Lg відповідають кубічній сплайн-кривій відповідно до рекомендацій виробника. Жоден із зразків грудного молока не містив виявлених пептидів β-Lg при заявленій межі виявлення 2,1 проміле, що підтверджує наші попередні результати (24). Чутливість конкурентного ІФА, швидше за все, була недостатньою для виявлення пептидів β-Lg, що правдоподібно зустрічається при низьких величинах ppb згідно з валовою оцінкою на основі відносної інтенсивності сигналу MS. Менш розведені зразки грудного молока (тобто 1/50 та 1/100), аналізовані методом ІФА, дали суперечливі результати через втручання матриці. Загалом, методи, що базуються на ІФА, можуть призвести до хибнопозитивних та хибнонегативних результатів при застосуванні для визначення мікроелементів у складних харчових матрицях, що підкреслює необхідність аналітичних методів, які не покладаються на розпізнавання антиген-антитіло (35).

Пошук пептидів коров’ячого молока в білкових гранулах

Дієтичні поліпептиди в рідинах організму, особливо в крові або грудному молоці, можуть сприйматися антитілами або асоціюватися з білками через неспецифічні взаємодії. Такий результат може також пояснити, чому методами ІФА не вдалося виявити ті білкові фрагменти, виявлені РС (26). Для того, щоб націлити на можливі інтактні білки коров'ячого молока або дієтичні пептиди, пов'язані з антитілами-носіями або білками в грудному молоці, 12% -на нерозчинна у ТСА білкова гранула була редукована/алкільована в денатураційному буфері (6 М гуанідину) і отримані триптичні перетравлення аналізували за допомогою ВЕРХ-МС/МС. Базу даних, що містить послідовності білків коров’ячого молока, шукали, використовуючи як специфічність розщеплення трипсину, так і неспецифічну розщеплення. В середньому майже 400 ендогенних білків на зразок виявляли з високою довірою (1% FDR, e Ключові слова: грудне молоко, білки коров’ячого молока, харчові алергени, перетравлення білків, ВЕРХ-МС/МС, вестерн-блот, β-лактоглобулін, грудне вигодовування

Цитування: Picariello G, De Cicco M, Nocerino R, Paparo L, Mamone G, Addeo F та Berni Canani R (2019) Екскреція пептидів, отриманих дієтичним коров'ячим молоком, у грудне молоко. Спереду. Nutr. 6:25. doi: 10.3389/fnut.2019.00025

Отримано: 20 грудня 2018 р .; Прийнято: 20 лютого 2019 р .;
Опубліковано: 12 березня 2019 р.

Антоніу Мануель Перес, Політехнічний інститут Браганса, Португалія

Арміндо Мело, Університет до Порту, Португалія
Стефано Сфорца, Пармський університет, Італія
Joost Gouw, Nutricia Research, Нідерланди