Інгібування активності карнітину пальмітоїлтрансферази-1 полегшує інсулінорезистентність у мишей із ожирінням, індукованих дієтою

Анотація

Ожиріння є основною проблемою західного суспільства, оскільки 10% населення страждає від надмірної ваги або ожиріння (1). Це накладає ризик для здоров'я людей, включаючи інсулінорезистентність та діабет 2 типу, що призводить до підвищеного ризику гіпертонії, дисліпідемії та серцево-судинних захворювань, таких як серцева недостатність (2).

Інсулінорезистентність виникає, коли організм не може сприйняти і використовувати глюкозу як джерело енергії при стимуляції інсуліном. Інсулінорезистентність впливає на низку тканин, включаючи печінку, скелетні м’язи, підшлункову залозу, жирову тканину та серце. Скелетні м’язи становлять понад 70% утилізації глюкози у всьому тілі (3), а тому є найважливішою системою органів, що контролює рівень глюкози в крові та загальну чутливість до інсуліну. Таким чином, будь-який терапевтичний підхід, який може покращити реакцію на інсулін у скелетних м’язах, може бути корисним для чутливості до інсуліну всього тіла та толерантності до глюкози.

Інсулінорезистентність скелетних м'язів супроводжується дисбалансом між поглинанням жирних кислот та β-окисленням жирних кислот (4,5). Надлишкове внутрішньоклітинне накопичення жирних кислот та їх метаболітів вважається ключовим посередником резистентності до інсуліну. Ці метаболіти включають діацилгліцерин (DAG) (6), керамід (7,8) та довголанцюговий ацил CoA (9), які, як було встановлено, мають підвищений рівень ожиріння та/або діабету. Дійсно, одним терапевтичним підходом для лікування інсулінорезистентності є підвищення окиснення жирних кислот, тим самим знижуючи рівень цих метаболітів. Крім того, було показано, що генетичні та фармакологічні маніпуляції з певними генами, пов’язаними з окисленням жирних кислот, для сприяння окисленню жирних кислот покращують чутливість до інсуліну (10–12).

Хоча посилення окислення жирних кислот може полегшити резистентність до інсуліну за рахунок зменшення метаболітів ліпідів, інші дані свідчать про те, що посилення окиснення жирних кислот може бути не корисним для лікування резистентності до інсуліну у людей із ожирінням та діабетом. По-перше, показано, що швидкість окислення жирних кислот збільшується при ожирінні та цукровому діабеті (13,14). По-друге, підвищене окислення жирних кислот також пов'язане із збільшенням неповного окислення жирних кислот (15, 16), що, як було показано, сприяє резистентності до інсуліну. Крім того, збільшення окислення жирних кислот може також потенційно зменшити окислення глюкози в м'язах через взаємний зв'язок між окисленням жирних кислот та глюкозою, що називається циклом Рендла (17). Цикл Рендла вперше був продемонстрований в ізольованому серці та на діафрагмових смужках. Однак його робота в м'язах все ще залишається суперечливою (18).

Карнітинпальмітоїлтрансфераза-1 (СРТ-1) є важливим ферментом, який бере участь у регуляції окислення жирних кислот у мітохондріях. CPT-1 каталізує перетворення цитоплазматичного довголанцюгового ацилу CoA в ацилкарнітин, який потім потрапляє в мітохондрії для β-окислення жирних кислот. Цей фермент розташований на зовнішній мембрані мітохондрій і є ферментом, що обмежує швидкість поглинання жирних кислот мітохондріями (19–21). Хоча генетичні нокаути печінки (22) та м'язів (23) ізоформ CPT-1 показали, що є ембріонально смертельними, фармакологічне інгібування CPT-1 ефективно знижує окислення жирних кислот (16,24).

Оксфеніцин (4-гідрокси-1-гліцин) є інгібітором окислення жирних кислот, який діє шляхом інгібування СРТ-1. Трансамінування оксфеніцину до його метаболіту, 4-гідроксифенілгліоксилату, необхідне для його фармакологічних дій (24). Мітохондріальний CPT-1 серця є більш чутливим до інгібування оксфеніцину та 4-гідроксифенілгліоксилату, ніж ізоформа печінки CPT-1 (25). Оскільки м’язова ізоформа СРТ-1 є переважною ізоформою в серці та скелетних м’язах (26), введення оксфеніцину in vivo переважно інгібує окислення жирних кислот у скелетних м’язах.

У цьому дослідженні ми намагалися визначити, чи зменшення, а не збільшення окислення жирних кислот у скелетних м’язах може полегшити резистентність до інсуліну у всьому тілі. Ми припустили, що фармакологічне інгібування CPT-1 зменшить окислення жирних кислот, одночасно збільшуючи окислення глюкози за допомогою механізму циклу Рендла в скелетних м'язах. Ми також досліджували, чи супроводжується це зменшення окислення жирних кислот покращенням чутливості до інсуліну.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Поводження з тваринами.

Всі дослідження були схвалені Комітетом з питань політики та догляду за тваринами в Університеті Альберти з питань охорони здоров'я та відповідали вимогам Канадської ради з догляду за тваринами. Самці мишей C57/BL6 (віком 12 тижнів; 20-25 г) були випадковим чином розподілені на дієту з низьким вмістом жиру (LFD) з 13% калорій з жиру (4% жиру за вагою) або дієту з високим вмістом жиру (HFD) 60% калорій від жиру (Research Diets Inc.) та годування відповідною дієтою протягом 12 тижнів. Мишей розміщували по одній клітці в кімнаті з контрольованою температурою і витримували 12/12-годинний цикл світло-темрява. Миші мали вільний доступ до їжі та води. Вага тіла та споживання їжі вимірювались одночасно кожного дня.

Наприкінці 12 тижнів тваринам щодня вводили інгібітор СРТ-1, оксфеніцин (150 мг/кг в/в), суспендований у 1 × PBS, або контроль носія протягом 4 тижнів. Тест на толерантність до глюкози (GTT) та тест на толерантність до інсуліну (ITT) проводили через 2 тижні лікування оксфеніцином. Мишам голодували протягом 16 год і робили внутрішньочеревну ін'єкцію глюкози в дозі 2 г/кг маси тіла. Глюкозу в крові вимірювали за допомогою системи Accu Check Advantage (Roche) з інтервалом у 15 хвилин протягом 90 хв. Через сорок вісім годин після GTT мишам голодували протягом 16 год і вводили внутрішньочеревно ін'єкцію інсуліну в дозі 0,3 одиниці/кг маси тіла. Глюкозу в крові вимірювали за допомогою системи Accu Check Advantage з інтервалом у 15 хвилин протягом 90 хв.

Оцінка метаболізму in vivo у цілому.

Оцінку метаболізму in vivo за допомогою непрямої калориметрії проводили за допомогою Oxymax CLAMS (Columbus Instruments). Спочатку тварин акліматизували в системі протягом 24 годин, а наступний 24-годинний період використовували для збору даних.

Тестування фізичних вправ.

Вправу виконували, бігаючи тварин на каліброваній біговій доріжці з приводом від двигуна (Columbus Instruments) зі швидкістю 3 м/хв протягом 1 хв з наступним збільшенням швидкості 4 м/хв протягом 1 хв, 5 м/хв протягом 1 хв, 6 м/хв 3 хв, 8 м/хв 14 хв, 9 м/хв 10 хв, 10 м/хв 7 хв, 12 м/хв 7 хв та 14 м/хв до виснаження. Перші 6 хв використовувались як період акліматизації для тварин. Виснаження визначали, як тварина проводила> 10 секунд поспіль на ударну сітку.

Обробка тканин.

Наприкінці 4-тижневого протоколу лікування тварин вбивали шляхом внутрішньочеревної ін’єкції пентобарбіталу натрію (12 мг) у годуванні в середині темного циклу. Тканини вирізали і негайно заморожували в рідкому азоті.

Визначення внутрішньоклітинних проміжних ліпідів.

Коротколанцюгові складні ефіри CoA визначали у 6% екстрактах хлорно-кислотної кислоти із заморожених тканин, як описано раніше (27). Довголанцюгові ефіри ацилу КоА аналізували за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, як описано раніше (28). Тріацилгліцерин (TAG) витягували з тканини за методом Фолча (29). Діацилгліцерин тканини (DAG) та кераміди визначали за допомогою аналізу, описаного раніше (7,30).

Визначення активності мітохондріальних ферментів.

Активність цитрат-синтази вимірювали в тканинних гомогенатах, контролюючи швидкість відновлення 5,5′-дитио-біс (2-нітробензойної кислоти) при 412 нм. Активність дегідрогенату β-гідроксиацил КоА (β-HAD) вимірювали в тканинних гомогенатах шляхом моніторингу швидкості зникнення NADH. Активність комплексу піруватдегідрогенази (PDH) визначали за допомогою модифікації аналізу радіоізотопного ферменту, описаного раніше (31,32).

Мембранне фракціонування та імуноблот-аналіз.

Заморожену порошкоподібну тканину гомогенізували за допомогою гомогенізатора Polytron протягом 30 с при 4 ° C в буфері для гомогенізації, що містить 50 ммоль/л трис HCl (рН 8), 1 ммоль/л ЕДТА, 10% (мас./Об.) Гліцерину, 0,02% Brij- 35, інгібітори фосфатази I та II (1: 100), інгібітор протеази (1: 1000) та 1 ммоль/л дитиотреїтолу. Після центрифугування при 10 000 г протягом 20 хв при 4 ° C вміст білка вимірювали за допомогою аналізу протеїну Бредфорда.

В експериментах, де вимагалося виявлення мембранного вмісту білків, порошкоподібні тканини гомогенізували та субфракціонували шляхом диференціального центрифугування за допомогою комерційного набору для екстракції білка (Calbiochem). Для визначення експресії ферментних білків гомогенати піддавали SDS-PAGE. Після гель-електрофорезу фракціоновані білки переносили на нітроцелюлозну мембрану методом мокрого перенесення. Буфер для перенесення містив 25 ммоль/л трис, 192 ммоль/л гліцину і 20% (об/об) метанолу. Мембрани блокували 10% (мас./Об.) Сухого знежиреного молока в сольовому розчині, забуференному Тріс, з 0,05% Tween 20 протягом 1 год при кімнатній температурі.

Для імуноблотингу мембрани інкубували з відповідною кількістю моноклональних або поліклональних антитіл проти цікавого білка при 4 ° С протягом ночі. Мембрани тричі промивали сольовим розчином, забуференним трис, з 0,05% Tween 20, потім зондували кон'югованим з пероксидазою хрону вторинним антитілом. Потім мембрани промивали сольовим розчином, забуференним Tris, з 0,05% Твін 20. Білки-мішені візуалізували за допомогою набору ECT Western Blotting Kit (PerkinElmer Inc, Waltham, MA).