Ідентифікація регулона деградації р-кумарату у Rhodopseudomonas palustris за допомогою Xpression, інтегрованого інструменту для обробки даних прокаріотичної РНК-Seq

АНОТАЦІЯ

Високопродуктивне секвенування кДНК, приготовленої з РНК, підхід, відомий як RNA-seq, набуває все більшого використання як метод аналізу транскриптомів. Незважаючи на численні переваги, широкомасштабному впровадженню цієї техніки заважає відсутність простих у використанні інтегрованих інструментів з відкритим кодом для аналізу даних генерованих послідовностей нуклеотидів. Тут ми описуємо Xpression, інтегрований інструмент для обробки даних прокаріотичної РНК-послідовності. Інструмент простий у використанні та повністю автоматизований. Він виконує всі основні завдання обробки, включаючи вилучення послідовності нуклеотидів, вирівнювання, кількісну оцінку, нормалізацію та візуалізацію. Важливо, що Xpression обробляє мультиплексовані та специфічні для ланцюга дані послідовностей нуклеотидів. Він витягує та обрізає певні послідовності з файлів і окремо кількісно визначає сенс і антисмислові читання в кінцевих результатах. Виходи інструменту також можна зручно використовувати для подальшого аналізу. У цій роботі ми показали корисність Xpression для обробки специфічних для ланцюга даних RNA-seq для ідентифікації генів, регульованих CouR, фактором транскрипції, який контролює деградацію p-кумарату бактерією Rhodopseudomonas palustris .

деградації

ВСТУП

RNA-seq - нещодавно розроблена методика глобального аналізу транскриптів мРНК, яка передбачає використання технології секвенування з високою пропускною здатністю (18). Він має ряд переваг перед традиційними технологіями на основі мікрочипів, зокрема покращена чутливість, збільшений динамічний діапазон та менша вартість. В результаті він стає найкращим інструментом для досліджень експресії генів. Незважаючи на багато переваг, широкому впровадженню РНК-послідовності перешкоджає відсутність простих у використанні інтегрованих інструментів з відкритим кодом для обробки даних послідовностей нуклеотидів, які генеруються як результат техніки. Для кожного експерименту з RNA-seq генеруються мільйони зчитувань необроблених послідовностей, що робить неможливою обробку даних послідовності без біоінформаційних інструментів.

Розроблено ряд інструментів для автоматичної обробки даних RNA-seq. Комерційні рішення, такі як Avadis NGS та Illumina CASAVA, пропонують широкі можливості, але їх вартість непомірна для невеликих лабораторій. Некомерційні інструменти, такі як ArrayExpressHTS (6) та rnaSeqMap (11), нещодавно були випущені, але жоден із існуючих інструментів не призначений спеціально для обробки даних прокаріотичних РНК-послідовностей. Завдяки меншим розмірам генома, дані прокаріотичної РНК-послідовності можна мультиплексувати, додаючи штрих-код до кожного зразка, щоб зменшити витрати на послідовність зразків. Крім того, для побудови інформації про напрямок прокаріотичних розшифровок можуть бути використані специфічні для побудови бібліотеки методи побудови (2, 8). Ці методи дають послідовності у власному напрямку, а також у напрямку зворотного доповнення щодо орієнтації відкритої рамки зчитування (2, 8). Навички програмування потрібні для налаштування існуючих біоінформаційних інструментів для обробки даних цих типів RNA-seq.

Тут ми описуємо Xpression, інтегрований інструмент, який ми розробили для обробки даних прокаріотичних РНК-послідовностей, створених за допомогою технології секвенування Illumina. Інструмент приймає прості команди від користувачів за допомогою графічного інтерфейсу, повністю автоматизований і закінчує всі завдання з обробки, починаючи від вилучення послідовності і до генерації загального файлу формату візуалізації, який можна відкрити за допомогою програмного забезпечення для візуалізації, такого як Artemis (http: // www.sanger.ac.uk/resources/software/artemis/) або вбудований переглядач геноміки (http://www.broadinstitute.org/igv/). Він буде обробляти дані, які не є специфічними для певної галузі. Але він також призначений для аналізу мультиплексованих та специфічних даних. Він витягує та обрізає певні послідовності з файлів і окремо кількісно визначає сенс і антисмислові читання в кінцевих результатах. Виходи з Xpression також можна зручно використовувати для подальшого аналізу. Наприклад, користувачі можуть застосувати статистичну програму, таку як DESeq (1), до звітів про експресію генів, щоб ідентифікувати диференційовано експресовані гени.

Нещодавнє генетичне та біохімічне дослідження пурпурової несірчаної фототрофної бактерії Rhodopseudomonas palustris показало, що гени couAB, що кодують ліозу/гідратазу еноїл-КоА та лігазу коферменту А, необхідні для деградації рослинних мономерів лігніну р-кумарат та кофеїн (9). У цьому ж дослідженні репресорний білок сімейства MarR, названий CouR, був визначений як зв'язуючий p-кумароїльний кофермент A (p-coumaroyl-CoA) для зниження експресії гена couAB. Результати кількісних експериментів з ПЛР із зворотною транскриптазою (RT-PCR) показали, що мутант couR мав рівні експресії couAB у 30-40 разів вищий, ніж у дикого типу. Тут ми використовували Xpression для обробки специфічних для ланцюга даних RNA-seq для подальшого дослідження регулону CouR. Це призвело до ідентифікації 11 додаткових генів, які, ймовірно, регулюються CouR.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Штами бактерій та умови росту. Штам R. palustris дикого типу CGA009 та мутант делеції couR, отриманий з CGA009 (9), вирощували анаеробно на світлі з сукцинатом (10 мМ) як джерелом вуглецю, як описано раніше (9, 10). Клітини в середині логарифмічної фази росту, де вони експресують гени деградації р-кумарату на високому рівні (15), спочатку охолоджували в крижано-водяній бані, а потім збирали шляхом центрифугування, а гранули заморожували в рідкому азоті, а потім зберігається при −80 ° C.

Аналізи електрофоретичної рухливості зсуву гелю. CouR очищали, як описано раніше (9), і аналізи зсуву гелю електрофоретичної рухливості проводили, як було описано раніше (9), за винятком того, що зонди, специфічні для промотора кожного гена, генерували за допомогою ПЛР-ампліфікації з геномною ДНК R. palustris CGA009 як матриці . Для кожного зонда посилювали всю міжгенну область.

Конструкція бібліотеки кДНК, специфічна для ланцюга, для РНК-послідовності. Клітини, які раніше зберігались при -80 ° C, розморожували і порушували биттям гранул, а РНК потім очищали від клітин, як описано раніше (8). Бібліотеку кДНК, специфічну для ланцюга, готували із загальної РНК за допомогою описаного раніше методу, який називався не надто випадковою (NSR) RNA-seq (2). Синтез першої та другої ланцюгів, побудова бібліотеки РНК-послідовностей NSR та секвенування ДНК в системі Illumina GA2 проводили, як описано раніше (2, 8). Для цього ми вказали довжини зчитування нуклеотидів 36 основ.

Установка Xpression. Xpression можна безкоштовно завантажити з веб-сайту лабораторії Harwood (https://depts.washington.edu/cshlab/html/rnaseq.html). Через природу залежного програмного забезпечення Biopython (4), SAMtools (13), Pysam та інструмента вирівнювання Burrows-Wheeler (BWA) (12), для встановлення Xpression потрібна правильно налаштована Unix-подібна операційна система. Веб-сайт пропонує дві альтернативи передачі Xpression на настільний комп’ютер. Для тих, хто має операційну систему, подібну до Linux або Unix, найкращим варіантом є використання автоматичного сценарію, що надається, який встановить все необхідне програмне забезпечення з джерела. Для тих, хто має операційну систему Windows або Mac OS, ми запропонували повністю операційне, незалежне від системи графічне середовище (Xpression VE), яке може запускати Xpression. Єдиним програмним забезпеченням, яке потребує Xpression VE, є безкоштовне програмне забезпечення для віртуалізації, яке називається VirtualBox (https://www.virtualbox.org/). Будь ласка, зверніться до посібника користувача віртуальної системи Xpression, доступного на веб-сайті лабораторії Harwood, щоб отримати вказівки щодо встановлення Xpression VE на комп’ютері вказівником миші. Цю програму можна легко встановити на настільному комп'ютері, ноутбуці або нетбуці.

Зображення графічного інтерфейсу Xpression. (A) Налаштування для аналізу даних РНК-послідовності дикого типу представлені як приклад. (B) Зображення вікна зразків параметрів.