Ідентифікація нової кістки гомініну з печери Денисова, Сибір за допомогою відбитків пальців колагену та аналізу ДНК мітохондрій

Саманта Браун

1 RLAHA, Оксфордський університет, OX1 3QY, Великобританія

Томас Хігем

1 RLAHA, Оксфордський університет, OX1 3QY, Великобританія

Вівіан Слон

2 MPI-EVA, Лейпциг, 04103, Німеччина

Сванте Пябо

2 MPI-EVA, Лейпциг, 04103, Німеччина

Маттіас Мейєр

2 MPI-EVA, Лейпциг, 04103, Німеччина

Катерина Дука

1 RLAHA, Оксфордський університет, OX1 3QY, Великобританія

Фіона Брок

3 Кренфілдський криміналістичний інститут, Університет Кренфілда, SN6 8LA, Великобританія

Даніель Комескі

1 RLAHA, Оксфордський університет, OX1 3QY, Великобританія

Ноемі Прокопіо

4 Факультет наук про життя Манчестерського університету, M13 9PL, Великобританія

Михайло Шунков

5 Інститут археології та етнографії, Новосибірськ, 630090, Росія

Анатолій Деревянко

5 Інститут археології та етнографії, Новосибірськ, 630090, Росія

Майкл Баклі

4 Факультет наук про життя Манчестерського університету, M13 9PL, Великобританія

Пов’язані дані

Анотація

Секвенування ДНК революціонізувало наше розуміння архаїчних людей у середній і верхній палеоліт. На жаль, хоча багато пам’ятки палеоліту містять велику кількість кісток, більшість із них не мають діагностичних характеристик, необхідних для традиційної морфологічної ідентифікації. В результаті відновлення останків людини плейстоценового віку надзвичайно рідко. Щоб обійти цю проблему, ми застосували метод колагенових відбитків пальців на більш ніж 2000 фрагментованих кістках з місця Денисової печери, Росія, з метою сприяння виявленню людських останків. В результаті нашого аналізу була ідентифікована одна гомінінова кістка (Денисова 11), підтримана за допомогою глибокого аналізу послідовності пептидів, і виявлено, що вона несе мітохондріальну ДНК неандертальського типу. Подальше радіовуглецеве датування виявило, що кістці було> 50000 років. Тут ми демонструємо величезний потенціал відбитків пальців колагену для виявлення залишків гомініну у дуже фрагментарних археологічних колективах, покращуючи ресурси, доступні для більш широких досліджень еволюції людини.

Таким чином, скам'янілості гомінінів з печери Денисова виявились надзвичайно цінними для нашого розуміння архаїчних популяцій гомінінів. Це підкреслюється винятковим станом збереження стародавніх молекул ДНК у деяких кістках, відновлених на цьому місці. Наприклад, денисованська фаланга (Денисова 3) містила> 70% ендогенної ДНК, що дає геном із високим охопленням (30x) 7. Однак, незважаючи на інтенсивні розкопки в Денисовій печері, серед тисяч виявлених кісток виявлено лише кілька решток гомінінів. Виявлені або зуби, або невеликі за розміром, як правило, фаланги, які рідше страждають фрагментацією, що призводить до втрати діагностичних характеристик. Така фрагментація, яка зумовлена як екологічною тафономією, так і діяльністю м’ясоїдів чи людини, призводить до високого відсотка костей, викопаних з цього та багатьох інших археологічних пам’яток, які неможливо ідентифікувати на основі їх морфології 3, 8. Тільки в Східній галереї Денисової печери під час розкопок між 2005 і 2013 роками було отримано приблизно 135 600 кісток; проте 128 591 не вдалося ідентифікувати 8 .

Тут ми застосовуємо метод ідентифікації видів за допомогою масових відбитків пальців пептидного колагену, відомий як Зооархеологія за допомогою мас-спектрометрії (ZooMS), до 2315 архівованих неідентифікованих фрагментів кісток з печери Денисова. Ці недіагностичні кістки були відібрані серед матеріалів, видобутих із Східної галереї печери в 2014 році. Залишки варіювались за розмірами, як правило, від 3 до 5 см, з кістками, які були досить великими, щоб бути корисними для додаткових аналізів (наприклад, радіовуглецю та ДНК аналіз), переважно вибраний. В недалекому минулому аналіз ZooMS успішно розрізнив різноманітний спектр ссавців, включаючи одомашнених таксонів 9, 10, диких наземних таксонів 11, 12 та морської фауни 13, а також деяких таксонів не ссавців 13, 14 . Для досягнення цього ZooMS використовує відбитки пальців з пептидної маси для аналізу домінуючого білка в кістці, колагену типу 1 (COL1), який відомий своєю довговічністю, особливо в прохолодному кліматі. Цей метод дав відбитки пальців колагену у зразках, що датуються

Результати

Залишається скринінг ZooMS на наявність гомініну

Раніше опубліковані маркери людини позначаються як A – G. Всі пронумеровані піки представляють підтверджені пептиди, що відповідають послідовності, що спостерігаються в людському колагені (крім Е, який відомий лише через схожість з гомологічними маркерами у інших видів 9).

Зразок, ідентифікований як той, що походить з гомініну, DC1227, був вийнятий з квадрата А-2, шар 12 Східної галереї. До відбору проб кістка важила 1,68 г, максимальна довжина - 24,7 мм, ширина - 8,39 мм. Для аналізу ZooMS було взято близько 36 мг (рис. 2). Кістка видається досить нічим не примітною, без будь-яких морфологічних ознак або доказів цілеспрямованої модифікації, тому її легко пропустити під час остеологічного аналізу.

Мікро-КТ DC1227

До подальшого руйнівного відбору проб для радіовуглецевого та мітохондріального ДНК-аналізу проводили мікро-комп’ютерну томографію (мікро-КТ). Враховуючи рідкість такого відкриття, мікро-КТ було визнано доцільним для того, щоб визначити райони, які зазнали видимої деградації, і тому їх слід уникати в майбутньому аналізі. Результати показали, що зразок дуже щільний, без ознак деградації кісток, незважаючи на низку діагенетичних мікротріщин, що проходять по всій довжині. Три з цих субмікронних тріщин проходять в безпосередній близькості одна від одної через кістку, однак вони не утворюють тріщини і, здається, не порушили структуру кістки. Сканування також підкреслило ступінь кислотного травлення та кісточок на поверхні кісток, що може бути результатом проходження через травну систему м’ясоїда (рис. 3). На місці виявлено низку м’ясоїдних тварин; враховуючи поширеність гієн у печері Денисова, представляється ймовірним, що кістка піддавалась кислотному травленню через шлункові кислоти гієни 8, 20 .

Радіовуглецевий аналіз DC1227

До нашої роботи всі виявлені на цьому місці кістки гомінінів були занадто малі для прямого радіовуглецевого датування, що означає, що визначення віку для цих людей визначалося виключно їхнім становищем щодо інших датованих матеріалів, фауни та відкладень 4. Цей метод передбачає, що залишки гомініну не зазнавали руху після осадження через біотурбацію або інші тафономічні впливи. Це особливо проблематично при розгляді обмежених хронологічних даних, які до цього часу були опубліковані для сайту. Визначення віку для Східної галереї обмежується одним шаром (шар 11) із низкою радіовуглецевих фініків на кістках, які мають сліди порізів або інші людські модифікації, і потенційно можуть виявити певний ступінь змішування в цьому шарі 4. Тому був проведений радіовуглецевий аналіз DC1227 для того, щоб визначити, що зразок не був перероблений або вторгнутий вище від послідовності. Хоча дотепер жодного наукового датування не було опубліковано для старішого шару 12 Східної галереї, дослідження фауни ссавців свідчать про те, що цей шар асоціюється з видами степових мешканців, можливо, представляючи стадію ізотопу кисню (OIS) 4, яка закінчилася

57 000 років тому 21, 22. Якщо DC1227 було виявлено in situ, очікувалося б повернення віку, що перевищує верхню межу радіовуглецевого датування (> 50 000 років).

Радіовуглецеве датування проводили в Оксфордському підрозділі прискорювачів радіовуглецю (ORAU), виконуючи стандартні процедури та протоколи 23, даючи оцінку віку> 49900 років до н.е. кісткового колагену. Результат повністю узгоджується з його виведеним геоархеологічним віком щодо стратиграфічної послідовності на цьому місці.

Ізотопні вимірювання вуглецю та азоту дали значення δ 13 C −17,3 ‰ та значення δ 15 N 16,4 ‰. Гомініни в регіоні, як правило, повертають значення ізотопів азоту між 13–15 ‰, як показано, наприклад, серед неандертальців печери Окладникова 24. Підвищені значення DC1227 можуть свідчити про різні дієтичні аномалії, включаючи дієту, багату білком, отриманим з організмів вищого трофічного рівня, таких як прісноводна риба 25, 26. Потрібні подальші дослідження, щоб помістити підвищені ізотопні значення у належний контекст, і про це буде повідомлено в майбутньому. Такі дослідження ізотопного складу гомініну та пов'язаної з ним фауни з Денисової можуть виявити важливу інформацію про раціони палеолітичних гомінінів, що мешкають на Алтаї, і такі дослідження зараз проводяться в Оксфордському університеті.

Послідовності мітохондріальної ДНК (mtDNA) із зразка DC1227

Ми витягли ДНК з 30,9 мг кісткового порошку з DC1227 27. Аликвотна частина екстракту була перетворена в одноланцюгову бібліотеку ДНК 28, яку збагатили для фрагментів мітохондріальної ДНК гомініну за допомогою мітохондріальних зондів людини 29. Ізольовані фрагменти ДНК секвенували і наносили на оновлену референтну мітохондріальну еталонну послідовність людини (rCRS). Загалом ми ідентифікували 282 502 унікальних фрагменти мтДНК довжиною понад 35 пар основ (Додаткова таблиця S1).

Щоб оцінити, чи були деякі фрагменти мтДНК давнього походження, ми скористались тим фактом, що основи цитозину (С) на кінцях молекул ДНК з часом схильні до дезамінування 30 і, як результат, читаються як тиміни (Т) ДНК-полімерази. Таким чином, древні фрагменти ДНК, вирівняні до контрольної послідовності, як правило, несуть високі частоти очевидних заміщень С на Т на своїх 5'- і 3'- кінцях 31, 32, 33. З фрагментів, що починаються або закінчуються в положеннях, де основою rCRS є C, 32,2% і 31,3% несли Ts на своїх 5′- і 3′-кінцях відповідно (Додаткова фігура S13), що вказує на те, що древні молекули ДНК гомініну присутні в DC1227.

Щоб визначити, чи є ендогенна мтДНК DC1227 найбільш тісно пов’язаною із сучасними геномами мітохондрій людини, неандертальця чи денісована, ми обмежили аналіз послідовностями, що несуть заміщення C на T відносно rCRS на одному з їх кінців 34, щоб зменшити вплив передбачуваного забруднення сучасною ДНК людини (додаткова інформація). Використовуючи 36665 таких послідовностей (Додаткова таблиця S1), мітохондріальний геном зразка DC1227 був реконструйований із середнім охопленням у 130 разів, залишивши 63 позиції, охоплені двома або меншою кількістю послідовностей, і чотири, де менше двох третин послідовностей несли ту саму основу. Таким чином, 67 позицій не можна було впевнено назвати.

Порівнюючи DC1227 мтДНК із повноцінною неандертальською мтДНК, визначеною на сьогоднішній день, вона несе п'ять базових відмінностей до неандертальської мтДНК Окладникова 2 33, знайденої приблизно в 60 км від Денисової печери, від 12 до 17 відмінностей від неандертальців із Західної та Південної Європи та 31 різниці до Мезмайська 1 з Кавказу 35 та до неандертальця, знайденого в Денисовій печері 5. Для порівняння, мтДНК DC1227 відрізняється між 174 і 354 основами до мтДНК інших груп гомінінів (Додаткова таблиця S2). Таким чином, під час філогенетичного аналізу (рис. 4) мітохондріальний геном DC1227 потрапляє у варіацію десяти неандертальців, за винятком 311 сучасних людей, десяти стародавніх сучасних людей, двох денисованців та гомініну середнього плейстоцену з Іспанії. Ми прийшли до висновку, що особа DC1227 несла мітохондріальний геном типу неандертальця і називатимемо його відтепер Денисовою 11.

Мт-ДНК шимпанзе використовували як зовнішню групу (не показано). Підтримка кожної гілки базується на 500 реплікаціях початкового завантаження. Див. Таблицю S2 щодо географічного походження давніх зразків.

Висновки

Методи

ZooMS

Від кожної з кісток у складі брали від 20 до 50 мг кісток і демінералізували в 0,6 М соляній кислоті (HCl) протягом 18 годин. Отриманий залишок видаляли в ультрафільтри з відсіканням молекулярної маси 30 кДа (MWCO) і центрифугували при 3700 об/хв протягом 1 години. Потім фільтрат двічі промивали 500 мкл 50 мМ бікарбонату амонію (AmBic) і додатково центрифугували при 3700 об/хв протягом півгодини після кожної обробки. Кінцевий залишок ресуспендували додатково AmBic (200 мкл), половину якого видаляли для створення резервного набору зразків перед перетравленням. Решта 100 мкл потім обробляли 0,2 мкг трипсину (клас секвенування; Promega UK) та інкубували при 37 ° С протягом 18 годин. Потім отриманий розчин змішували з матричним розчином 1 мкл розчину α-ціано-4-гідроксикилотної кислоти (10 мг/мл у 50% ацетонітрилі (ACN)/0,1% трифтороцтової кислоти (TFA)), даючи змогло кристалізуватися і аналізували за допомогою мас-спектрометра Bruker Ultraflex II (Bruker Daltonics, Бремен) MALDI Tof/Tof. Отримані мас-спектри були перевірені на маркери людини 9, 12 за допомогою програмного забезпечення FlexAnalysis.

КТ сканування

КТ проводили за допомогою мікросканера Nikon XT H 225 з передавальною мішенню. Були зроблені спроби зберегти дозування якомога меншою, щоб уникнути пошкодження зразка, тому сканування проводили при 70 кВ та 80 мкА. Загалом було зроблено 1448 проектів із двома кадрами на проекцію, з експозицією, встановленою на 100 мс, та збільшенням × 7,2. Дані реконструювали за допомогою програмного забезпечення CT Pro 3D та обробляли за допомогою програмного забезпечення VG Studio Max 2.1.

Аналіз мітохондріальної ДНК

Вилучення ДНК та підготовка бібліотеки

30,9 мг кісткового порошку видалено з DC1227 за допомогою стоматологічної бормашини. ДНК витягували за допомогою протоколу на основі діоксиду кремнію, призначеного для отримання коротких молекул ДНК 27, 36. 10 мкл екстракту ДНК (E3128) перетворювали в одноланцюгову бібліотеку ДНК (A9301), як описано 28, 36. Кількість молекул ДНК у бібліотеці оцінювали за допомогою цифрової краплинної ПЛР (BioRad QX 200), використовуючи 1 мкл як вхід для аналізу EvaGreen (BioRad) з праймерами IS7 та IS8 37. Бібліотека була штрих-кодована двома унікальними індексами 36, 38 та посилена за допомогою ДНК-полімерази AccuPrime Pfx (Life Technologies) 39. Продукти ампліфікації очищали за допомогою набору для очищення ПЛР MinElute (Qiagen); і визначено кількісно на фотоспектрометрі NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies).

Мітохондріальний захоплення та секвенування

Ампліфікована бібліотека (A9317) була збагачена протоколом 29 захоплення гібридизації на основі бісеру, використовуючи 52-мерні зонди 40, розроблені в одній парі базових плиток на rCRS (посилання Національного центру біотехнологічної інформації [NCBI]> NC_012920) у два раунди захоплення, використовуючи 1 мкг та 0,5 мкг вхідної ДНК відповідно. Захоплену бібліотеку (L5502) секвенували на платформі MiSeq (Illumina), використовуючи парні кінці (2 × 76 циклів) із конфігурацією подвійного індексу 38. По одній екстракційній заготівлі ДНК та одній заготівлі для підготовки бібліотеки проводили всю процедуру як негативні контролі.

Обробка та відображення послідовностей

Базовий дзвінок виконувався за допомогою дрохви (Illumina). Послідовності адаптерів були обрізані, а зчитування вперед і назад повернуто в єдині послідовності 41. Послідовності, у яких відсутня ідеальна відповідність очікуваним штрих-кодам, були відкинуті. Картографування до еталонного геному проводили за допомогою BWA 42, з параметрами «-n 0,01 -o 2 -l 16500» 7. Дублікати ПЛР видаляли шляхом злиття послідовностей з однаковими координатами початку та кінця вирівнювання, використовуючи bam-rmdup (https://github.com/udo-stenzel/biohazard). Послідовності довжиною понад 35 основ з якістю відображення більше 30 були збережені для подальшого аналізу.

Філогенетичний аналіз

Для реконструкції мтДНК DC1227 використовувались послідовності, що несуть кінцеві заміщення на Т. Термінал Ts у першому або останньому положеннях кожної послідовності перетворювались у Ns, щоб зменшити вплив помилок послідовності, отриманих при пошкодженні, під час виклику консенсусу. Базу консенсусу визначали, якщо позиція охоплювалася принаймні трьома послідовностями, і якщо принаймні 67% послідовностей, тобто більше двох третин, що перекриваються, несли однакову базу 34 .

МтДНК була суміщена з мтДНК 311 сучасних людей 43, 10 стародавніх сучасних людей 31, 44, 45, 46, 47 десяти неандертальців 5, 33, 35, 48, 49, двох денисованів 3, 4 середнього плейстоцену гомініну 34 та шимпанзе (Pan troglodytes,> NC_001643) 50 від MAFFT 51. Кількість базових відмінностей між послідовностями та деревом, що приєднується до сусідів, з 500 реплікаціями завантажувального репліка 52 на основі цих відмінностей було отримано за допомогою MEGA6 53 .

Додаткова інформація

Як цитувати цю статтю: Браун, С. та ін. Ідентифікація нової кістки гомініну з печери Денисова, Сибір за допомогою відбитків пальців колагену та аналізу ДНК мітохондрій. Наук. Респ. 6, 23559; doi: 10.1038/srep23559 (2016).

Код приєднання: Послідовність мітохондріального геному зразка DC1227 (Денисова 11) була депонована в GenBank (номер приєднання> KU131206).