Ідентифікація популяції нейронів кори головного мозку з активним сном

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

Відредаговано Сачо Б. Нельсоном, Університет Брандейса, штат Уолтем, штат Массачусетс, та прийнято Редакційною комісією 23 травня 2008 р.

Анотація

Наявність повільних хвиль великої амплітуди в ЕЕГ є основною характеристикою, яка відрізняє мозкову активність під час сну від тієї, що виникає під час неспання. Незважаючи на те, що нейрони, активні в режимі сну, були ідентифіковані в інших областях мозку, нейрони, які спеціально активуються під час повільного сну, раніше не описувались в корі головного мозку. Ми виявили популяцію клітин в корі, яка активується під час сну у трьох видів ссавців. Ці кортикальні нейрони є підмножиною GABAergic інтернейронів, які експресують нейронний NOS (nNOS). Оскільки експресія Fos у цих нейронах, активних у режимі сну, nNOS-імунореактивних (nNOS-ir) паралельно змінюється в інтенсивності повільно-хвильової активності в ЕЕГ, і ці нейрони інвертуються нейромедіаторними системами, раніше залученими до контролю сну/неспання, коркові nNOS -іронні нейрони можуть бути частиною нейробіологічного субстрату, який лежить в основі гомеостатичної регуляції сну.

Добре відомо, що сон має оздоровчі властивості (1) та сприяє виконанню вивченої поведінки (2, 3); навпаки, депривація сну призводить до дефіциту когнітивних функцій та результатів (4). Наявність повільних хвиль великої амплітуди в ЕЕГ є ознакою, яка відрізняє мозкову активність під час сну від неспання. Оскільки інтенсивність повільних хвиль, виміряна в дельта-діапазоні ЕЕГ (1,0–4,0 Гц), видається гомеостатично регульованою та пропорційною до попередньої тривалості пробудження (5), передбачається, що активність повільних хвиль (SWA) пов’язана з відновлювальна функція сну та синаптичної пластичності (2, 3, 6).

Нейронна схема, що лежить в основі SWA, включає кортикоталамокортикальну петлю та взаємодію між активованим гіперполяризацією струмом катіону (Ih) та низькопороговим струмом Ca 2+ (It) у таламокортикальних нейронах (7, 8). В даний час невідомо, чи є кора головного мозку активним учасником або просто пасивним конвеєром динаміки SWA, що залежить від історії сну. Ідентифікація окремої популяції активних сну нейронів кори, таких як базальний передній мозок (BF) (9) та преоптично-передній гіпоталамус (POAH) (10–13), допомогла б розрізнити ці альтернативи.

В експериментах, проведених на трьох видах ссавців, ми виявили, що GABAergic інтернейрони, що експресують фермент нейронний NOS (nNOS), активуються як під час спонтанного сну, так і під час відновлення сну (RS) після депривації сну (SD). Частка nNOS-імунореактивних (nNOS-ir) нейронів, які активуються під час сну, корелюється з показником інтенсивності SWA, відомим як "дельта-енергія" (14, 15). Оскільки нейрони nNOS-ir активні під час сну інервуються нейромедіаторними системами, раніше залученими до контролю сну/неспання, коркові нейрони nNOS-ir можуть бути раніше нерозпізнаним типом клітин, що беруть участь у SWA, і частиною нейробіологічного субстрату, який лежить в основі гомеостатичної регуляції сну.

Результати

Експресія Фос збільшується в нейронах коркового nNOS під час РС.

Експресія Fos раніше використовувалася для ідентифікації активних сном ділянок мозку в межах POAH, зокрема, вентролатеральної (10) та медіанної (12) преоптичних областей. Ми використовували цю методологію разом із імуномаркіруванням для фенотипових маркерів для ідентифікації конкретних нейрональних популяцій, які активні під час сну у трьох видів гризунів [див. Супровідну інформацію (SI), рис. S1 для схематичного опису експериментальних протоколів]. В ході цих досліджень ми спостерігали, що популяція нейронів кори головного мозку, яка експресує nNOS, демонструє сильно підвищену експресію Fos під час РС після періоду СД. Ці "активні уві сні" нейрони nNOS-ir були інтенсивно забарвлені, як правило, мали біполярну або багатополярну форму, мали діаметр ≈ 10–15 мкм і розташовувались у всіх коркових шарах. Ці анатомічні особливості нейронів nNOS-ir (рис. 1D) дуже подібні до тих, про які повідомлялося (16, 17). Ми також спостерігали велику кількість слабо забарвлених клітин nNOS в корі. Оскільки імунозабарвлення слабо забарвлених клітин не надійно мітило клітинні процеси і, отже, не дозволяло однозначно визначити імунозабарвлені нейрони з фонового сигналу, подальший аналіз проводили лише на інтенсивно забарвлених клітинах nNOS-ir.

Як зазначено на рис. 1 та рис. S2, кількість нейронів Fos +/nNOS-ir у корі щурів значно збільшується протягом РС, періоду, як правило, пов'язаного зі зниженим неспанням, збільшенням загального часу сну (рис. 1А) та збільшення SWA під час сну з нешвидким рухом очей (NREM) (рис. 1B). Оскільки нейрони nNOS-ir знаходяться в безлічі кіркових областей та в інших областях мозку, ми оцінили регіональну варіацію експресії Fos у нейронах nNOS-ir. Подвійно мічені клітини Fos +/nNOS-ir були знайдені в декількох ділянках кори і в кількох кортикальних шарах під час RS, тоді як дуже мало клітин з подвійною міткою спостерігалося під час SD (рис. 1 C і D). 1E демонструє значне збільшення клітин Fos +/nNOS-ir у всіх обстежених ділянках кори. Частка подвійно мічених клітин також зростала під час РС у хвостатому путамені, однак, частка в цій області мозку була меншою, ніж у будь-якій дослідженій корі. Відсоток подвійно мічених клітин не відрізнявся між RS та SD в перифорнічній ділянці гіпоталамуса (рис. 1E), області, в якій розташовані активні клітини.

Ідентифікація активних сну нейронів в корі головного мозку щурів. (A) Протягом 2,5-годинного періоду РС, що слідував за 6-годинним SD, неспання значно зменшилося (розподіл нейронів P +/nNOS-ir у двох репрезентативних ділянках мозку. Сині кружечки представляють однокрасні нейрони nNOS-ir, а помаранчеві квадратики подвійно забарвлених нейронів Fos +/nNOS-ir. Мало нейтралів подвійного забарвлення виявляється в корі після SD, тоді як багато подвійних нейронів виявляється в корі після RS. (E) Частка Fos +/nNOS-ir клітин було значно більшим у групі RS, ніж у групі SD у кожній кортикальній області та в хвостатому путамені. Дані є середнім ± SEM. *, Р +/nNOS-ір нейронів було знайдено під час RS відносно неспання у всіх восьми кортикальних в обстежених ділянках (рис. 2). У хвостатому путамені миші відсоток подвійно мічених клітин був значно вищим у задній частині під час РС, але не в передній частині (рис. 2С).

Параметри сну та експресія Fos в нейронах nNOS-ir миші та кори хом'яків під час спонтанного сну та неспання. (А) Мишей вбивали в чотири моменти часу протягом циклу світло/темрява; кількість сну/неспання та рівні ЕЕГ SWA були розраховані для 2,5-годинного періоду, перш ніж вони були вбиті. Проведено статистичне порівняння між усіма групами; літери у верхній частині стовпчиків вказують на суттєві відмінності (клітини P +/nNOS-ir були значно вищими при ZT2.5, ніж при ZT8.5 і, таким чином, паралельно високим рівням SWA. У всіх групах відсоток Fos +/nNOS- ir клітини в корі миші високо корелювали з енергією дельти NREM (взаємозв'язок представлений тут як напівжурнал). (C) У хом'яків, убитих після впливу постійного світла протягом принаймні 2 тижнів, профіль експресії Фос у nNOS- ir клітини були подібні до мишей: найвищий відсоток клітин Fos +/nNOS-ir був виявлений у CT3 під час неактивної фази, коли ЕЕГ SWA високий, а найменша частка у CT9-12, коли ЕЕГ SWA низька. фаза, частка клітин Fos +/nNOS-ir низька при CT15 і зростає, оскільки борг під час сну накопичується в кінці активної фази (CT21–24). Дані представлені як середнє значення ± SEM.

Нейрони Fos +/nNOS здаються унікальною популяцією кіркових інтернейронів з активним сном.

Нейрони nNOS-ir є найменшим відомим на сьогодні підрозділом нейронів GABAergic проекції в корі миші. Наступним більшим підрозділом є нейрони, які експресують нейропептид Y (NPY) (19). Тому ми провели експерименти з потрійним маркуванням Fos, nNOS та NPY в корі миші і виявили, що Fos експресується в нейронах, забарвлених як для nNOS, так і для NPY, але не виявлено в нейронах, забарвлених лише для NPY (рис. 4А).

Імуногістохімічна характеристика активних уві сні клітин nNOS-ir. (A) Потрійне фарбування для імунореактивності nNOS (a), NPY (b) та Fos (c) в корі миші під час RS. Нейрони, які експресують як nNOS, так і NPY, містять Fos (стрілки), але нейрони, що експресують лише NPY, не містять Fos (трикутники). (B) Подвійне фарбування імунореактивності кальретиніну (трикутники) та Fos (стрілка) в корі миші, що вказує на те, що мало нейронів, що містять каретинін, експресують Fos під час RS.

Експеримент 4: Спонтанна активність у спокої у хом'яків.

Самці золотистих хом'яків (M. auratus) (річка Чарльз) розміщувались індивідуально та забезпечені ходовими колесами. Дані про ритм рухової активності збирали та аналізували за допомогою ClockLab (Actimetrics). Через 1 тиждень за циклу LD14: 10 світла/темряви хом'яків випускали при постійному слабкому освітленні (LL; 200–300 люкс). Через мінімум 2 тижні в ЛЛ хом'яків вбивали на одній з восьми фаз циркадного циклу (CT3: n = 3; CT6: n = 5; CT9: n = 3; CT12: n = 4; CT15: n = 3; CT18: n = 3; CT21: n = 3; CT24/0: n = 4). Хом'яків глибоко знеболювали пентобарбіталом (20 мг на 100 г маси тіла; внутрішньовенно) і перфузували 25 мл гепаринізованого 0,01 М PBS з подальшим 100 мл холодного 4% параформальдегіду в 0,1 М фосфатному буфері. Мозок фіксували протягом ночі при 4 ° C.

Гістохімічні методи.

Мозок видаляли, фіксували протягом 4 год у формаліні, урівноважували в PBS 30% сахарозою і зберігали при 4 ° C. Для щурів коронарні зрізи, що охоплюють область від 0 мм до -5 мм від брегми, вирізали при 40 мкм на замерзаючому мікротомі. Для мишей весь мозок вирізали при 40 мкм. Мозок хом'ячка вирізали на кріостаті при 40 мкМ.

У дослідженні з потрійною міткою зрізи мозку миші спочатку фарбували на Fos методом ABC/DAB-Ni, а потім обробляли для маркування подвійною флуоресценцією nNOS/NPY. Зрізи мозку миші інкубували протягом ночі в антитілах мишей проти nNOS (1: 5000; Sigma-Aldrich) при кімнатній температурі. Тканину промивали в PBS, інкубували в біотинільованому ослиному анти-мишачому IgG, промивали в PBS і інкубували в кон’югаті стрептавідину Alexa Fluor 594 (1: 500; Invitrogen). Тканину знову промивали в PBS і інкубували у кролячих анти-NPY (1: 1000) антитіл. Тканину промивали в PBS і інкубували в ослиному анти-кролячому IgG Alexa Fluor 488 (1: 500; Invitrogen) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Потім тканину встановлювали на предметне скло з желатиновим покриттям і закривали за допомогою кріпильних середовищ Fluoromount (Electron Microscopy Sciences).

Кількість клітин.

Зрізи мозку досліджували під світловою мікроскопією (Leica DM5000B), обладнану ПЗС-відеокамерою, що працює з комп’ютерною системою анатомічного картографування та аналізу зображень (StereoInvestigator; Microbrightfield). Один дослідник, сліпий до умов лікування, проводив підрахунок клітин. Регіони для підрахунку клітин nNOS були обрані шляхом двостороннього окреслення кори та хвостового путамена при малому збільшенні потужності (об'єктив × 5). Для бічного гіпоталамуса конкретна область підрахунку була нанесена на карту шляхом розміщення дорсальної сітки 750 × 500 мкм до форніксу при малому збільшенні потужності (об'єктив × 5). Потім вибрані області сканували при великому збільшенні (об'єктив × 20) на наявність Fos-позитивних (Fos +) та Fos +/nNOS подвійно мічених нейронів. Нейрони вважалися Fos +, якщо вони містять чорний продукт реакції Ni + -DAB, який був темнішим, ніж візуально встановлений поріг. Клітини nNOS підраховували в зрізах мозку в місцях -2,0 мм, -2,8 мм та -3,6 мм від брегми у щурів; в місцях +1,0 мм, -1,5 мм та -3,0 мм від брегми у мишей; і в місцях 0 мм, -1,7 мм і -2,5 мм від брегми у хом'яків. Підрахунки були усереднені та використані для подальшого статистичного аналізу.

Статистичні методи.

Дані аналізували за допомогою одностороннього аналізу ANOVA та тесту Стьюдента – Ньюмена – Кілса. Дані були представлені як середні значення ± SEM. Відмінності вважалися значними у P ¶ Кому слід адресувати листування. Електронна пошта: thomas.kilduffsri.com

Вклади авторів: D.G., H.O.d.l.I. та T.S.K. розроблені дослідження; D.G., J.P.W., D.B., R.K.R. та H.O.d.l.I. виконані дослідження; P.J.S. внесли нові реагенти/аналітичні інструменти; D.G., J.P.W., D.B., R.K.R., H.O.d.l.I. та T.S.K. проаналізовані дані; та D.G., J.P.W., T.S. та T.S.K. написав роботу.

Автори не заявляють конфлікту інтересів.

Ця стаття є прямим поданням PNAS. С.Б.Н. є запрошеним редактором запрошеним редактором.