Хронічне фармакологічне пригнічення EGFR призводить до серцевої дисфункції у мишей C57BL/6J

Корделія Дж. Баррік

кафедра генетики Університету Північної Кароліни, Чапел-Хілл, штат Північна Кароліна 27599

b Навчальна програма з токсикології, Університет Північної Кароліни, Чапел-Гілл, штат Північна Кароліна 27599

Мін Ю.

кафедра генетики Університету Північної Кароліни, Чапел-Хілл, штат Північна Кароліна 27599

c Програма з усної біології, Університет Північної Кароліни, Чапел-Гілл, штат Північна Кароліна 27599

Ханн-Сянг Чао

d Навчальна програма з генетики та молекулярної біології, Університет Північної Кароліни, Чапел-Гілл, штат Північна Кароліна 27599

Девід В. Тредгілл

кафедра генетики Університету Північної Кароліни, Чапел-Хілл, штат Північна Кароліна 27599

b Навчальна програма з токсикології, Університет Північної Кароліни, Чапел-Гілл, штат Північна Кароліна 27599

c Програма з усної біології, Університет Північної Кароліни, Чапел-Гілл, штат Північна Кароліна 27599

d Навчальна програма з генетики та молекулярної біології, Університет Північної Кароліни, Чапел-Хілл, штат Північна Кароліна 27599

Анотація

Вступ

Рецептор епідермального фактора росту (EGFR) є прототипом члена сімейства рецепторів тирозинкіназ ERBB, який також включає ERBB2, ERBB3 і ERBB4 (Wells, 1999). Зв’язування лігандів індукує гомо- або гетеродимеризацію рецепторів з подальшим фосфорилюванням залишків тирозину в карбокси-кінцевому хвості, створюючи місця стикування, що ініціює внутрішньоклітинні сигнальні каскади (Schlessinger, 2000). Було підраховано, що посилення або конститутивна передача сигналів через EGFR відбувається приблизно у третини всіх новоутворень людини; крім того, аберрантна сигналізація пов’язана з поганим прогнозом, включаючи відсутність реакції на традиційну хіміотерапію та зниження виживання (Salomon et al., 1995; Woodburn, 1999; Nicholson et al., 2001).

З тих пір, як EGFR вперше був запропонований як цільовий препарат проти раку майже двадцять років тому (Sato et al., 1983; Gill et al., 1984; Masui et al., 1984), досягнення в галузі розкриття лікарських препаратів дали безліч інгібіторів, спрямованих на рецептор. Зокрема, інгібітори тирозинкінази (TKI), які блокують активність EGFR, конкуруючи з аденозинтрифосфатом (АТФ) за зв’язування з киназою кишені рецептора, показали ефективність для декількох типів раку (Jimeno and Hidalgo, 2006). Два ІФІ EGFR, Gefitinib/Iressa (AstraZeneca) та Erlotinib/Tarceva (OSI Pharmaceuticals), отримали схвалення регуляторних органів для використання у хворих на рак, тоді як деякі інші оцінюються в поточних клінічних випробуваннях як моно- або комбінаторні терапії (Marshall, 2006; Steeghs et al., 2007). Із величезними успіхами, досягнутими в терапії раку, і наслідком збільшення тривалості життя після діагнозів, деякі види раку зараз сприймаються і трактуються як хронічні, а не термінальні захворювання (Disis and Rivkin, 2003; Michener and Belinson, 2005; Markman, 2006; Burton et al., 2007; Snyderman, 2007). Хоча побічні ефекти цілеспрямованої терапії, такі як ІТК, вважаються незначними порівняно з традиційними хіміотерапевтичними препаратами, тепер пацієнти можуть піддаватися дії цих препаратів роками, а не місяцями. Однак довгострокові фізіологічні наслідки пригніченої активності EGFR невідомі.

Матеріали і методи

1) Тварини та фармакологічне лікування

Аналіз кишкової пухлини

У віці трьох місяців мишей B6-Apc Min/+ евтаназували та видаляли шлунково-кишкові шляхи від пілорусу до прямої кишки. Тонку кишку розрізали на третини, а сліпу кишку і товсту кишку відокремили. Сегменти обережно промивали PBS, щоб видалити фекальний матеріал, розрізали поздовжньо, розпилювали на 3 мм папір Whatmann і фіксували на ніч при 4 ° C у 4% параформальдегідіді. Поліпи підраховували та вимірювали їх діаметри за допомогою дисекційного мікроскопа з мікрометром, що дозволяє розпізнати поліпи діаметром більше 0,3 мм.

Ехокардіографія

Трансторакальну ехокардіографію (ТТЕ) проводили на початковому рівні та перед жертвою за допомогою зонда 30 мГц на ультразвуковому знімку Vevo 660 (VisualSonics). Мишей дикого типу В6 злегка знеболювали за допомогою 1-1,5% ізофторану та місцевого депілятора, що застосовували перед тим, як помістити в ліве бічне пролежне положення під теплову лампу для підтримки температури тіла на рівні 37 ° С. Частота серцевих скорочень підтримувалась від 450 до 500 ударів на хвилину. Отримані двовимірні короткі та довгі осі лівого шлуночка. Реєстрації М-режиму реєстрували і використовували для визначення кінцевого діастолічного діаметра лівого шлуночка (ЛШ) (ЛШВ, d), кінцевого систолічного діаметра ЛШ (ЛШВ, с), діастоли товщини задньої стінки ЛШ (LVPWTh, d) та товщини задньої стінки ЛШ систола (LVPWTh, s) протягом трьох серцевих циклів. Фракційне вкорочення НН розраховували за формулою% FS = (LVED, d-LVED, s)/(LVED, s). Всі вимірювання проводились двома незалежними спостерігачами, засліпленими для групи лікування.

Гістологія

Експресія гена

Загальну РНК екстрагували з нижньої половини ЛШ у мишей дикого типу В6 з використанням TRIzol (Invitrogen). Після обробки ДНКазою 500 нг загальної РНК транскрибували за допомогою зворотного архіву кДНК високої ємності (Applied Biosystems). Визначено експресію маркерів гіпертрофії передсердного натрійуретичного пептиду (Nppa) та натрійуретичного пептиду мозку (Nppb), про та антиапоптотичних маркерів (Bcl2l1, Bax та Bad) та рецепторів та лігандів ERBB (Egf, Nrg1, Dt, Erbb1 та Erbb2). за допомогою кількісної ПЛР у режимі реального часу (qPCR) з використанням Taqman Univeral Master Mix та праймерів та зондів Assays-on Demand (Applied Biosystems). Результати представлені як середні зміни складок щодо контрольних груп. Реакції проводили на машині Stratagene MX3000P із програмним забезпеченням для аналізу. Порогові цикли (КТ) визначали за допомогою програмного алгоритму, що призначає базову лінію флуоресценції на основі показань до експоненціального посилення. Змінення експресії в складках обчислювали за допомогою методу 2 -ΔΔcT (Livak та Schmittgen, 2001), з Actb або Gusb як ендогенних контролів.

Аналізи фосфорилювання in vivo

В6 самцям мишей дикого типу (n = 2), яких витримували на контрольній або експериментальній дієті протягом 90 днів, вводили підшкірно 5 мкг/г маси тіла EGF (R&D Systems) у PBS. Через 10 хвилин мишей евтаназували, печінку та серця видаляли, заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C. Заморожені тканини обробляли ультразвуком у 5–10 мл/г тканини буфера для лізису, що складається з 20 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 10% гліцерину, 1% Triton X-100, 1 мМ PMSF, 10 мкг/мл лейпептину, 10 мкг/мл апротиніну, 1 мМ ванадату натрію та 10 мМ β-гліцерофосфату при 4 ° C. Тканинні лізати очищали центрифугуванням протягом 10 хв при 4 ° C, а концентрації білка визначали за допомогою аналізу Бредфорда (Bio-Rad). Білкові лізати (15 мкг для печінки та 30 мкг для серця) відокремлювали денатурацією 7,5% додецилсульфату натрію в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) і переносили на мембрани PVDF (Bio-Rad). Білкові плями інкубували протягом ночі при 4 ° C з кролячими поліклональними антитілами, що розпізнають EGFR (RB-1417-P1, Labvision), фосфо-EGFR (Tyr1086) (36-9700, Zymed) або фосфо-p44/42 MAP кіназа (Thr202/Tyr204 ) (Клітинна сигналізація) з наступною інкубацією з кон’югованими антитілами до пероксидази хрону козла (1858413, Пірс) та виявленням з посиленою системою хемілюмінесценції (Amersham Pharmacia/GE Healthcare).

Статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення +/- стандартна помилка середнього значення (SEM). Дані контрольних груп об'єднувались, коли не було суттєвої різниці між параметрами. Непараметричний тест рангової суми Вількоксона був використаний для порівняння кількості та розміру пухлини між групами лікування. Для порівняння даних між відповідними групами лікування та контрольної групи використовували t-тест Манна-Уїтні або непарного Стьюдента. Тест Крускала-Уолліса або дисперсійний аналіз (ANOVA) використовували для виявлення значущості шляхом лікування. Всі аналізи проводили за допомогою програмного забезпечення StatView (SAS). P 3 H AG-1478 показав, що розподіл тканин є найвищим у печінці (Ellis et al., 2006), яка також має найвищий вміст загального білка та фосфо-EGFR. Щоб визначити, чи пригнічує хронічний вплив AG-1478 на дієтичну активність EGFR, ми досліджували загальний та фосфорильований рівні білка EGFR та ERK1/2 у лізатах печінки мишей дикого типу B6, яких годували або контрольними, або дієтами AG-1478, що містять протягом 90 днів. Зразки печінки від мишей на AG-1478, яким вводили 5 мкг/г маси тіла EGF перед жертвою для підвищення рівня фосфо-EGFR, мали знижений рівень фосфо-EGFR та фосфо-ERK1/2 у порівнянні з контролем (відносна щільність смуг зменшилась на 48% та 78% відповідно), хоча загальний рівень білка EGFR був подібним (рис. 1).

Імуноблот-аналіз лізатів печінки. Миші-самці B6 дикого типу піддавались дії інгібітора малих молекул EGFR AG-1478 під час дієти AIN 93G (AG-1478) або лише дієти AIN 93G (контроль) протягом трьох місяців (n = 2). (A) Вестерн-блот і (B) кількісне визначення активації EGFR.

Попередні звіти продемонстрували, що вплив дієти незворотними інгібіторами малих молекул EGFR, такими як EKB-569, різко інгібує утворення кишкових поліпів у моделі мишей Apc Min/+ сімейного колоректального раку (Torrance et al., 2000; Roberts et al., 2002). Отже, для біологічного та кількісного тестування пероральної доставки AG-1478 односеменних підстилок B6-Apc Min/+ обох статей відлучали на чау, що містить AG-1478 (144 мг/кг), або контрольну чау з годуванням ad libitum до 90-денного віку після чого їх кишкові шляхи видаляли і підраховували кількість пухлин кишечника. AG-1478 зменшив кількість поліпів на 45% порівняно з контролем (табл. 1), майже ідентично такому, як повідомлялося про інший оборотний інгібітор EGFR EKI-785 (40 мг/кг/день) за подібних експериментальних умов (Torrance et al., 2000), але менше, ніж 87% зменшення кількості пухлини, про яке повідомляли для EKB-569 (20 мг/кг/добу). Це встановлює протипухлинну ефективність AG-1478 у мишей Apc Min/+ і демонструє, що пероральне введення в їжу є ефективним шляхом.