Дієтичний білок тріски відновлює інсулінову активацію транслокації фосфатидилінозитол 3-кінази/Akt та GLUT4 до Т-канальців у скелетних м’язах у щурів із ожирінням з високим вмістом жиру

Анотація

Розвиток периферичної резистентності до інсуліну є важливою особливістю діабету 2 типу (1,2). Скелетні м’язи, на які припадає> 75% утилізації глюкози в постпрандіальному стані (1), є привабливою терапевтичною метою для профілактики цього захворювання. Механізм, за допомогою якого інсулін збільшує поглинання глюкози в м’язах, передбачає транслокацію чутливого до інсуліну транспортера глюкози GLUT4 з внутрішньоклітинного місця зберігання до плазматичної мембрани та Т-канальців (3–5). Показано, що транслокація GLUT4 є дефектною в скелетних м’язах інсулінорезистентних та хворих на цукровий діабет 2 типу (6–8). Інсулін стимулює транслокацію GLUT4, активуючи внутрішню активність його рецептора тирозинкінази щодо внутрішньоклітинних субстратів (5). У скелетних м'язах це призводить до фосфорилювання тирозину субстрату рецептора інсуліну (IRS) -1 та IRS-2, що веде до рекрутингу та активації 3-кінази фосфатидилінозитолу (PI), ключового ферменту в регуляції стимульованого інсуліном транспорту глюкози (9).

Ідентифікація ефекторів PI 3-кінази, що беруть участь у регуляції транспорту глюкози, є предметом інтенсивного дослідження. Сюди входять серин/треонінкінази Akt (також звана протеїнкіназа B [PKB]) та атипова протеїнкіназа C (aPKC). Докази впливу Akt та aPKC на інсулінозалежну регуляцію транспорту глюкози в м’язових клітинах випливають із досліджень трансфекції, що використовують або кіназну неактивну, або надмірну експресію/конститутивно активні форми кіназ (10–13). Тоді як дефект активації інсуліну PI 3-кінази добре встановлений у м’язах резистентних до інсуліну тварин (14–17), потенційна роль будь-якого Akt aPKC у патогенезі інсулінорезистентності залишається недостатньо визначеною. Використовуючи щурів з високим вмістом жиру як модель ожиріння, пов’язаної з інсулінорезистентністю, ми нещодавно виявили, що дія інсуліну як на активність Akt, так і на кіназу aPKC притупляється в скелетних м’язах цих щурів (14). Ці порушення передачі сигналів інсуліну були пов’язані з повним скасуванням інсулін-стимульованої транслокації GLUT4 як до плазматичної мембрани, так і до домів Т-канальців поверхні м’язових клітин (14).

Багато зусиль витрачається на пошук нових терапевтичних підходів для подолання резистентності до інсуліну у людей. Дієтичні втручання виявились корисною та ефективною тактикою сенсибілізації тканин цілі до інсуліну у тварин (18). Наприклад, було показано, що поліненасичені жирні кислоти ω-3, отримані з риби, покращують чутливість до інсуліну у щурів, які харчуються дієтою з високим вмістом жиру (19). Зовсім недавно ми досліджували вплив харчових білків на чутливість до інсуліну при ожирінні, спричиненому дієтою. Ми виявили, що дієтичний білок тріски, але не казеїн або соєвий білок, запобігав розвитку стійкості до інсуліну у всьому тілі, нормалізуючи поглинання глюкози, стимульоване інсуліном, у м’язах щурів, що харчуються жирами. Це спостерігалося, незважаючи на подібний приріст маси тіла, ожиріння та експресію TNF-α як у жировій тканині, так і в скелетних м’язах серед різних дієтичних груп (20).

Тому це дослідження було проведено для з'ясування клітинних механізмів, що викликають сенсибілізуючу дію інсуліну білка тріски у щурів із ожирінням, що харчуються жиром. Більш конкретно, ми перевірили гіпотези, згідно з якими білок тріски запобігає резистентності до інсуліну скелетних м’язів шляхом 1) посилення передачі сигналів інсуліну до PI 3-кінази, Akt та aPKC, 2) збільшення експресії білка GLUT4 та/або 3) поліпшення транслокації GLUT4 до поверхня м’язових клітин.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Матеріали.

Лікування тварин.

Гіперінсулінеміко-еуглікемічний затискач та ін’єкція індикатора.

Гостра стимуляція інсуліном.

Щурам, які голодували протягом ночі, вводили або фізіологічний розчин, або інсулін (8 одиниць/кг) протягом 4 хв, як описано раніше (4). М'язи швидко вирізали і негайно заморозили в рідкому азоті. М'язи гастрокнемія гомогенізували в шести обсягах буфера для лізису (20 ммоль/л Трис, рН 7,5, 140 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л CaCl2, 1 ммоль/л MgCl2, 10% гліцерину, 10 ммоль/л пірофосфату натрію, 10 ммоль/л NaF, 2 ммоль/л Na3VO4, 2 мг/мл бензамідину та 1 ммоль/л PMSF) та коктейль інгібіторів протеази. Окадаєву кислоту (100 нмоль/л) додавали в лізисний буфер для активності кінази Akt та aPKC. М'язові гомогенати розчиняли в 1% NP-40 протягом 1 год при 4 ° C і центрифугували при 14000g протягом 10 хв. Супернатант використовували для досліджень сигналізації про інсулін, як описано нижче.

Фосфорилювання тирозину рецептора інсуліну та IRS.

М’язові лізати (1 мг білка) імунопреципітували 2 мкг антифосфотирозину (4G10), зв’язаного з білком A-сефарозою, протягом ночі при 4 ° C. Імунний комплекс тричі промивали PBS (pH 7,4), що містить 1% NP-40 і 2 ммоль/л Na3VO4, ресуспендували в буфері Леммлі і кип'ятили протягом 5 хв. Білки розчиняли на SDS-PAGE (6% гель) і обробляли для вестерн-блот-аналізу.

Активність ПІ 3-кінази.

М'язовий лізат (1 мг білка) імунопреципітували 2 мкг анти-IRS-1, приєднаного до білка A-сефарози, протягом ночі при 4 ° С. Імунний комплекс промивали двічі промиванням I (PBS, рН 7,4, 1% NP-40 і 2 ммоль/л Na3VO4), двічі промиванням II (100 ммоль/л Трис, рН 7,5, 500 ммоль/л LiCl і 2 ммоль/л Na3VO4) і двічі з промиванням III (10 ммоль/л Tris, рН 7,5, 100 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л EDTA та 2 ммоль/л Na3VO4). Гранули ресуспендували в 70 мкл кіназного буфера (8 ммоль/л Трис, рН 7,5, 80 ммоль/л NaCl, 0,8 ммоль/л ЕДТА, 15 ммоль/л MgCl2, 180 мкмоль/л АТФ і 5 мкКі [γ- 32 P] ATP) та 10 мкл ультразвукової суміші PI (20 мкг l-α-PI, 10 ммоль/л Tris, рН 7,5 та 1 ммоль/л EGTA) протягом 15 хв при 30 ° C. Реакцію зупиняли додаванням 20 мкл 8 моль/л HCl, змішували з 160 мкл CHCl3: CH3OH (1: 1) і центрифугували. Нижні органічні фази були помічені на обробленій оксалатом силікагельній пластині ТШХ і розвинені в CHCl3: CH3OH: H2O: NH4OH (60: 47: 11,6: 2). Пластину висушили та візуалізували за допомогою авторадіографії з посилюючим екраном при -80 ° C.

Діяльність Akt/PKB.

М’язовий лізат (1 мг білка) імунопреципітували 4 мкг анти-Akt 1/2, зв’язаного з білком G-сефарозою, протягом 4 год при 4 ° C. Імунний комплекс промивали двічі промиванням I (PBS, рН 7,4, 1% NP-40 і 100 мкмоль/л Na3VO4) і двічі промиванням II (50 ммоль/л трис, рН 7,5, 10 ммоль/л MgCl2 і 1 ммоль/л DTT). Гранули ресуспендували в 30 мкл кіназного буфера (50 ммоль/л Тріс, рН 7,5, 10 ммоль/л MgCl2, 1 ммоль/л DTT, 8 мкмоль/л АТФ, 2 мкКі [γ- 32 P] АТФ і 50 мкмоль/л Crosstide) протягом 30 хв при 30 ° C. Продукт реакції розчиняли на 40% акриламідному гелі та візуалізували за допомогою авторадіографії з посилюючим екраном при -80 ° C.

Атипова активність ПКС (ζ/λ).

М'язовий лізат (1 мг білка) імунопреципітували 2 мкг анти-РКС (ζ/λ) протягом ночі при 4 ° C, потім імунний комплекс збирали на білку A/G-сефарозі протягом 2 годин. Намистини промивали двічі промиванням I (PBS, рН 7,4, 1% NP-40 і 2 ммоль/л Na3VO4), двічі промиванням II (100 ммоль/л Трис, рН 7,5, 500 ммоль/л LiCl і 100 мкмоль/л Na3VO4) і двічі з промиванням III (50 ммоль/л Трис, рН 7,5, 10 ммоль/л MgCl2 і 100 мкмоль/л Na3VO4). Гранули ресуспендували в 30 мкл кіназного буфера (50 ммоль/л Трис, рН 7,5, 10 ммоль/л MgCl2, 40 мкмоль/л АТФ, 5 мкКі [γ- 32 P] АТФ і 5 мкг основного білка мієліну) протягом 12 хв при 30 ° C. Реакцію зупиняли додаванням буфера Леммлі і нагрівали протягом 30 хв при 37 ° С. Продукт реакції розщеплювали на 13% SDS-PAGE. Гель висушували та візуалізували за допомогою авторадіографії з посилюючим екраном при -80 ° C.

Субклітинне фракціонування.

Плазматичні мембрани, поперечні канальці (Т-канальці) та збагачені GLUT4 внутрішньоклітинні мембрани були виділені з 8–10 г м’язів (змішаний гактрокнемій та квадрицепс) за допомогою процедури, розробленої в нашій лабораторії (4,22). Цей протокол субклітинного фракціонування широко характеризувався імунологічними та ферментативними маркерами (4,22). Коротше кажучи, ця методика дозволяє одночасно і відокремлено виділяти плазматичну мембрану, Т-канальці та внутрішньоклітинні везикули мембрани з того самого гомогенату м’язів. Вміст GLUT4 визначали у фракціях, отриманих від щурів, введених фізіологічним розчином або інсуліном методом Вестерн-блот, як описано раніше (14). Характеристика мембранних фракцій представлена в таблиці 1 та на рис. 6А і добре узгоджується з нашими попередніми дослідженнями (4,22).

Вестерн-блот-аналіз.

Мембрани (10 мкг) або м’язові гомогенати (50 мкг) піддавали SDS-PAGE (7,5% гелю) та електрофоретично переносили у фільтруючі мембрани полівінілідендифториду (PVDF) протягом 2 годин. Потім мембрани PVDF блокували на 1 год при кімнатній температурі буфером I (50 ммоль/л Трис-HCl, рН 7,4, 150 ммоль/л NaCl), що містить 0,04% NP-40, 0,02% Твін-20 і 5% знежиреного молока з наступною інкубацією протягом ночі при 4 ° C з первинними антитілами, як описано в легендах на малюнку. Потім мембрани PVDF промивали протягом 30 хв, після чого проводили 1 год інкубації або проти мишачого, або проти кролячого імуноглобуліну G, кон’югованого з пероксидазою хрону в буфері I, що містить 1% BSA. Мембрани PVDF промивали протягом 30 хв у буфері I, а імунореактивні смуги виявляли посиленим методом хемілюмінесценції. М'язовий стандарт (незв'язана неочищена фракція мембрани) запускали на кожному гелі для порівняння зразків різних імуноблотів.

Аналіз даних.

Авторадиографи аналізували за допомогою лазерної скануючої денситометрії за допомогою настільного сканера Agfa (Arcus II; Agfa-Gavaert, Morstel, Бельгія) та кількісно визначали за допомогою програми Зображення Національного інституту здоров’я (WEB: rsb.info.nih.gov/nih-image/) . Дані представлені як середні значення ± SE. Ефекти дієтичних білків порівнювали за допомогою ANOVA. Вважалося, що відмінності є статистично значущими при введенні г d - [3 H] глюкози. Швидкість інфузії глюкози, опосередкована інсуліном, необхідна для підтримання еуглікемії, була значно нижчою (P -1 · хв -1). Дія інсуліну на все тіло у щурів, що страждали ожирінням з високим вмістом жиру та споживали білок тріски, виявилось подібним до того, що спостерігався у контрольній нежирній групі, що годується чау (16,9 ± 2,0 мг · кг -1 · хв -1). Стимульоване інсуліном поглинання глюкози в м’язах шлунково-кишкового та чотириголового м’язів ожирілих щурів, що годувались жиром, також було значно більшим (P −1 · хв −1) і подібним до спостереження у щурів, що годувались чау (112,8 ± 13,5 нмоль · g −1 · Хв -1). Швидкість інфузії глюкози та поглинання глюкози 2-дезокси-d - [3 H] не суттєво відрізнялися між тваринами, які годували казеїном та соєвим білком. Базальне поглинання глюкози в м'язах вимірювали після ін'єкції індикатора в кінець сольового затиску, і було виявлено, що джерело харчових білків не впливає на них (дані не наведені).

Вплив харчових білків на рецептор інсуліну та субстрат-1 рецептора інсуліну фосфорилювання.

Спочатку ми дослідили, чи здійснює білок тріски свою сприятливу дію на чутливість до м’язового інсуліну за рахунок посилення фосфорилювання тирозину рецепторів інсуліну та білків IRS, тим більш проксимальних етапів у розповсюдженні сигналу інсуліну до ефекторів нижче за течією (5). Ін’єкція інсуліну in vivo спричинила значне збільшення вмісту фосфотирозину як у рецепторах інсуліну (рис. 1А та В), так і в білках IRS (рис. 1А та С) у м’язах щурів, яких годували чау. Стимулюючий ефект інсуліну на фосфорилювання тирозину IR/IRS був подібним у щурів, яких годували дієтою з високим вмістом жиру, незалежно від джерела білка (рис. 1А-С).

Вплив харчових білків на активність ПІ-3-кінази, пов'язану з IRS-1.

Активація PI 3-кінази являє собою важливий етап у стимулюванні транспорту глюкози інсуліном (9). Тому ми вимірювали вплив годування жирами та дієтичних білків на стимульовану інсуліном активність PI 3-кінази в імунопреципітатах IRS-1, оскільки IRS-1 є основною ізоформою, відповідальною за засвоєння глюкози в м’язах. У скелетних м'язах щурів, яких годували чау, інсулін сильно активував асоційовану з IRS-1 ПІ 3-кіназу (рис. 2). Годування щурів дієтою з високим вмістом жиру або казеїном, або соєвим білком суттєво погіршувало здатність інсуліну активувати фермент (зниження на 60% порівняно з щурами, яких годували чау). Вражаюче, що дієтичний білок тріски повністю запобігав втраті дії інсуліну на активність PI 3-кінази у щурів з високим вмістом жиру.

Вплив харчових білків на активацію Akt та фосфорилювання GSK-3α/β.

Потім ми визначили, чи модулюють білки з їжею статус активації Akt, вимірюючи його фосфорилювання на обох регуляторних ділянках (Ser473 та Thr308) та його активність щодо екзогенного субстрату. Інсулін стимулював фосфорилювання Akt як на Ser473, так і на Thr308 у тварин, яких годували чау (рис. 3А). Індуковане інсуліном фосфорилювання Akt не відрізнялося у щурів із високим вмістом жиру, які споживали ні казеїн, ні тріску, ні соєві білки. Потім активність кіназ Akt вимірювали в імунопреципітатах Akt-1/2, використовуючи кростид, пептид, що містить мотив GSK-3 в якості субстрату. Ми виявили, що активність Akt знижується (-40%, P 2+ -ATPase відновлюється в цій фракції. Фракція TT містить деякий рівень Ca 2+ -ATPase, що, швидше за все, відображає відновлення невеликої кількості тріад (де T-канальці важливіше, що на відновлення всіх цих маркерів не впливало ні ожиріння (чау проти високої жирності), ні джерело харчових білків.

ОБГОВОРЕННЯ

Такі поживні речовини, як вуглеводи та ліпіди, є важливими модуляторами дії інсуліну на метаболізм глюкози (18). Однак набагато менше відомо про вплив харчових білків на чутливість до інсуліну та гомеостаз глюкози. Недавні наші висновки про те, що білок тріски, але не казеїн або соєвий білок, перешкоджають розвитку стійкості до інсуліну скелетних м’язів у пацюків із ожирінням, що харчуються жиром, вказує на те, що дієтичні білки можуть також мати значний вплив на дію інсуліну (20). Тому важливо окреслити клітинні механізми, за допомогою яких харчові білки впливають на чутливість до інсуліну в м’язах.

Відомо, що активація Akt PI 3-кіназою залежить від фосфорилювання залишків Thr308 та Ser473 PDK-1 (37,38) та передбачуваного PDK-2 (39) відповідно. Однак ми виявили, що як годування з високим вмістом жиру, так і споживання білка тріски модулюють активність Akt, не впливаючи на стан фосфорилювання ферменту на Ser473 та Thr308. Таким чином, хоча активація Akt інсуліном виглядає незмінною на основі статусу фосфорилювання Akt, фактична здатність кінази фосфорилювати екзогенний субстрат істотно змінилася. Цю очевидну розбіжність можна пояснити тим фактом, що PI 3-кіназа активувалась принаймні втричі інсуліном у всіх дієтичних групах (рис. 2), можливо, дозволяючи достатню продукцію PI (3,4,5) P3, для повної активації PDK і фосфорилювання Akt, що свідчить про те, що інший механізм може враховувати модуляцію активності Akt кінази шляхом годування жирами та харчових білків.

Загадковим аспектом цього дослідження є спостереження, що інсулін зміг мобілізувати подібну кількість GLUT4 з ІМ, виділених із тварин, що харчуються соєвим білком та білком тріски, тоді як транслокація транспортера до Т-канальців спостерігалася лише у останніх групи. В даний час визнано, що GLUT4 циклічно рухається через складну мережу внутрішньоклітинних органел, включаючи мережу транс-Гольджі та ендосомну систему, і що інсулін впливає на рух між цими органелами (версія 44). Навряд чи фракція ІМ, виділена за нашою процедурою, містить усі ці органели. Таким чином, можливо, що, незважаючи на той факт, що зникнення GLUT4 в ІМ, виділеному з щурів, що годувались білком тріски та соєвим білком, було подібним, націлювання на ці везикули було не однаковим. Наприклад, можливо, що везикули GLUT4, які виходять із пулу ІМ у тварин, що харчуються соєвим білком, потрапляють в інші внутрішньоклітинні відділи, що призводить до порушення мобілізації до клітинної поверхні.

Іншим питанням, яке заслуговує на увагу, є здатність тварин, що харчуються соєвим білком, підтримувати здатність транслокувати GLUT4 до плазматичної мембрани, тоді як щури, які годували казеїном, повністю не реагували на інсулін щодо транслокації. Незважаючи на це, стимульований інсуліном транспорт глюкози в м'язи, а також передача сигналів інсуліну до шляху PI 3-кінази/Akt також були порушені в цих двох групах. Одне з можливих пояснень полягає в тому, що, хоча "класичний" профіль передачі сигналу інсуліну був майже однаковим між групами, що харчуються казеїном та соєвим білком, можна стверджувати, що інші сигнальні шляхи впливають на м'язи попередньої групи. Наприклад, також було продемонстровано, що незалежний від PI 3-кінази шлях CAP-Cbl-TC10 також бере участь у транслокації GLUT4 на поверхню клітини (версія 45). Тому цілком можливо, що цей шлях є більш активним у тварин, що харчуються соєвим білком, порівняно з тими, що годуються казеїном. Слід зазначити, однак, що транслокація GLUT4 до плазматичної мембрани без транслокації до Т-канальців була недостатньою для надання чутливості до інсуліну тваринам, що годувались соєвим білком.

Підводячи підсумок, це дослідження пропонує переконливі докази того, що харчові білки є важливими модуляторами сигналізації та дії інсуліну в скелетних м’язах щурів. Крім того, ми показали, що дієтичний білок тріски є потужним і природним сенсибілізуючим інсуліном агентом, який нормалізує статус активації шляху PI 3-кінази/Akt у поєднанні з підвищеною транслокацією GLUT4 у Т-канальці у людей, що страждають ожирінням з високим вмістом жиру. щури. Визначення точного молекулярного механізму, за допомогою якого харчовий білок тріски покращує передачу сигналу інсуліну до PI 3-кінази/Akt, допоможе визначити нові терапевтичні засоби для профілактики та лікування резистентності до інсуліну.