Дентигеруміцин: бактеріальний медіатор симбіозу мурашиних грибів

Анотація

Мурахи-вирощувачі грибів вступають у мутуалістичні асоціації як з грибом, який вони вирощують для їжі, так і з актинобактеріями (Псевдонокардія spp.), які виробляють селективні антибіотики для захисту цього грибка від спеціалізованих грибкових паразитів. Ми проаналізували одну таку систему на молекулярному рівні і виявили, що бактерія пов'язана з мурашкою Apterostigma dentigerum виробляє дентигеруміцин, циклічний депсипептид із сильно модифікованими амінокислотами, для вибіркового пригнічення асоційованого паразитичного гриба (Есковопсис sp.).

Ми розпочали з виділення бактерії (Псевдонокардія sp.), сорт гриба та паразитичний гриб (Есковопсис sp.) від мурахи (Apterostigma dentigerum) гніздо, зібране в Гамбоа, Панама в 2001 р. (код колонії CC011120-4, див. Додаткові методи в Інтернеті; рис. 1а). Псевдонокардія штам, виділений з кутикули A. dentigerum сильно пригнічує Есковопсис ізолят, отриманий з тієї самої колонії (рис. 1b), тоді як сорт грибів відносно стійкий до штаму бактерій (Додатковий рис. 1 в Інтернеті). Початковий LC/MS аналіз як етилацетатного екстракту цільної рідкої культури, так і метанольного екстракту агарової пластинчастої культури Псевдонокардія штам виявив присутність одного основного компонента (додаткова фіг. 2 в Інтернеті). Подальше дослідження, що включало широкомасштабне культивування (8 л) та пробне фракціонування через флеш-колонку C18 та ВЕРХ, підтвердило, що ця основна сполука, яку ми назвали дентигеруміцином (1, 2а), відповідає за Есковопсис гальмування.

(a) Аптеростигма гриб, що вирощує мураху (код колонії CC011120-4), що показує працівника Apterostigma dentigerum. (b) Попарний випробувальний біопроб демонструє в пробірці пригнічення паразитичного грибка Есковопсис (зверху і знизу) від Псевдонокардія (посередині) (агарова пластина діаметром 8,5 см).

(a) Структура дентигуруміцину (1) містить сильно модифіковані амінокислотні одиниці, такі як піперазинові кислоти. (b) Крива сприйнятливості доза-реакція, що наносить графік log концентрації дентигеруміцину в мкМ проти щільності клітин грибів (одиниця флуоресценції) Есковопсис, демонструючи пригнічення паразитичного гриба дентигеруміцином з коефіцієнтом мікроіндукції 2,8 мкМ. На панелях помилок відображається s.d.

Дентигеруміцин виділяли у вигляді білого порошку, що має молекулярну формулу C40H67N9O13, як визначено за допомогою мас-спектрометрії ESI-TOF з високою роздільною здатністю у поєднанні з спектральними даними ЯМР 1 H та 13 C (Додаткова таблиця 1 та Додаткова фігура 3 в Інтернеті). Спектр ЯМР 1Н демонстрував 1 синглетний протон низхідного поля при 9,50 м.д., 2 амідні дублетні протони і 12 протонів між 4 і 6 м.д. Спектри ЯМР 13 C та gHSQC показали 7 амідних або складних ефірних карбонільних атомів вуглецю, 5 вуглеводнів, що містять кисень, 9 вуглеводнів, що містять азот, та 19 аліфатичних вуглецевих сигналів. Аналіз спектральних даних gHSQC дозволив призначити всі однозв’язкові кореляційні зв'язки вуглецю та протону та виявив дев'ять протонів, приєднаних до гетероатомів.

Інтерпретація спектрів ЯМР gCOSY, TOCSY, gHSQC та gHMBC призначила шість субструктур, похідних амінокислот, і одну субструктуру, отриману з полікетиду. Сюди входять дві одиниці піперазинової кислоти (Pip-1 та Pip-2), γ-гідроксипіперазова кислота (γ-OH-Pip), β-гідроксилейцин (β-OH-Leu), N-гідроксиланін (N-OH-Ala), аланін та бічний ланцюг, що несе піран, ацил (рис. 2а та додатковий рис. 4а в Інтернеті). Ключові кореляції HMBC забезпечили послідовність амінокислотних одиниць та ацильний бічний ланцюг (додаткова фіг. 4b), яка завершила площинну структуру дентигеруміцину (рис. 2а). Ми визначили стереохімію дентигеруміцину, використовуючи комбінацію спектроскопічного аналізу, реакцій деградації та дериватизації, як зазначено нижче. Відносна конфігурація піранового кільця в ацильному бічному ланцюзі була визначена за допомогою кореляцій ROESY (Додаткова Рис. 5a в Інтернеті). Відносна конфігурація двох послідовних стереогенних центрів у β-OH-Leu була встановлена як 23S * та 24S * автор J-на основі аналізу конфігурації 8 (додаткова рис. 5b). Відносну конфігурацію γ-гідроксипіперазової кислоти визначали як (5S *, 7S *) -γ-OH-Pip за допомогою константи сполучення 1 H- 1 H та спектрального аналізу ROESY 9 (додаткова рис. 5c).

Бо безкоштовно N-Не очікувалось, що OH-Ala реагує з FDLA, ми перетворили N-ОН до N-H шляхом обробки дентигуруміцину TiCl3 (див. Додаткові методи) 14. Ми підтвердили це перетворення за допомогою ЯМР 1 H, gCOSY, TOCSY, gHSQC та gHMBC (додаткова фіг. 3) продукту відновлення (8) та шляхом мас-спектрального аналізу з високою роздільною здатністю (Додаткова таблиця 2 в Інтернеті). Продукт (8) потім гідролізували, дериватизували L-FDLA і аналізували LC/MS, як описано раніше, для встановленняS конфігурації.

Ми визначили абсолютну конфігурацію ацильного бічного ланцюга за допомогою спектрального аналізу CD комплексу Mo2 (OAc) 4 1,2-діолу при C29 та C30 (див. Додаткові методи). Виходячи з емпіричного правила 15, комплекс дентигуруміцину, який має негативний знак в індукованому спектрі CD, повинен мати 29S і 30Р. конфігурації, якщо 1,2-діольний фрагмент приймає передбачувану низькоенергетичну конформацію (Додаткова Рис. 7 в Інтернеті). Цей результат також встановив 33S і 34Р. конфігурації на основі раніше визначеної відносної стереохімії.

Хімічна дериватизація піперазинових кислот була особливо складною 9, і їх абсолютна конфігурація була встановлена головним чином за допомогою рентгенівської кристалографії. Поєднання швидкого гідролізу, вдосконалених методів Марфі та модифікованих методів Мошера забезпечує загальноприйнятний підхід до характеристики цих амінокислот, що все частіше зустрічаються.

Дентигеруміцин - це раніше не повідомлений депсипептид, що містить незвичні амінокислоти - піперазинову кислоту, γ-гідроксипіперазову кислоту, β-гідроксилейцин та N-гідроксиаланін - поряд з бічним ланцюгом, отриманим з полікетиду, що містить кільце пірану. Натуральними продуктами, найбільш подібними до дентигеруміцину, є поліоксипептини 16 та аурантиміцини 17, які мають деякі амінокислоти, спільні з дентигеруміцином. Однак вони не мають тієї самої структури ядра, як дентигеруміцин, оскільки інші амінокислоти відрізняються - найголовніше завдяки додатковій одиниці піперазинової кислоти в дентигеруміцині, яка, як очікується, дасть зовсім іншу конформацію серцевини. Тому що все це було ізольовано від Стрептоміцес spp., ймовірно, що деякі біосинтетичні елементи були спільними 18 .

Хоча аналізи чашки Петрі показують, що дентигеруміцин явно інгібує паразитичний гриб більше, ніж культивований гриб (Додаткова Рис. 8 в Інтернеті), ми оцінили його мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК = 2,8 мкМ) в аналізі рідких культур проти Есковопсис паразит з колонії CC011120-4 (рис. 2b). Аналіз рідких культур не підходить для культивованого гриба, оскільки він дуже повільно росте в рідкій культурі. Дентигеруміцин також інгібує Candida albicans дикий тип, C. albicans ATCC10231 та стійкий до амфотерицину C. albicans ATCC200955 зі значеннями MIC 1,1 мкМ. Ці результати дозволяють припустити, що в Аптеростигма симбіозу, як і в системі південного соснового жука, опосередкованої мікангіміцином 2,19, аскоміцетом (Есковопсис sp.) чутливий, тоді як базидіоміцет (сорт) стійкий.

Примітка: Додаткова інформація та інформація про хімічні сполуки доступна на веб-сайті Nature Chemical Biology.