Часовий курс виснаження та переповнення вітаміну D у самок мишей репродуктивного віку C57BL/6

Антоній М Беленчія

Кафедри 1 Фізіологія харчування та фізичні вправи і

Сара Джонсон

2 Біомедичні науки та

3 Центр наук про життя Бонда, Університет Міссурі, Колумбія, штат Міссурі

Алісса С Кішнік

Кафедри 1 Фізіологія харчування та фізичні вправи і

Шеріл С Розенфельд

2 Біомедичні науки та

3 Центр наук про життя Бонда, Університет Міссурі, Колумбія, штат Міссурі

Катерина Петерсон

Кафедри 1 Фізіологія харчування та фізичні вправи і

Анотація

Кількість статей, включаючи ключові слова «дефіцит вітаміну D», «гризуни» та «тваринні моделі».

Дослідження VDD на тваринах, включаючи самок репродуктивного віку, повинні враховувати латентний період, характерний для дієтичних жиророзчинних вітамінів, таких як вітамін D, та забезпечувати необхідний час впливу, щоб повторити фенотипічні ефекти, що спостерігаються в популяціях людей з VDD. І навпаки, вторинні системні ускладнення, спричинені довгостроковою ВДД, можуть виникнути та збити результати експерименту. З цих причин тимчасовий перебіг та відповідь 25-гідроксивітаміну D (25 (OH) D) (загальноприйнятий найкращий показник стану вітаміну D) на дієти VDS та VDD у лабораторних гризунів вимагає розслідування, особливо у найбільш широко використовуваних та часто використовуваних штам мишей для метаболічних досліджень, миші C57BL/6 ('Black 6'). 21 Отже, нашими поточними цілями було: 1) охарактеризувати часовий хід індукції та переповнення ВДД у самок мишей репродуктивного віку C57BL/6 та 2) дослідити довгострокові наслідки ВДД, особливо щодо складу тіла, показник метаболічного здоров'я.

Матеріали і методи

Тварини та дієти.

Обидва експерименти були схвалені та проведені відповідно до Університету Міссурі IACUC (протокол 7753). Усі процедури відповідали Керівництву NIH щодо догляду та використання лабораторних тварин. 34 Усі експерименти були проведені як попередня робота для більш масштабного дослідження, що вивчало вплив DOHaD ВДД матері під час вагітності на довгостроковий метаболічний стан здоров'я нащадків. Самки мишей C57BL/6J (вік 8 тижнів) були придбані у лабораторії Jackson Labs (Jackson Labs; Bar Harbor, ME). Щоб визначити ефективний графік для індукування та реверсування ВДД, сироватку відбирали у статевозрілих 8-тижневих самок мишей C57BL/6, яких потім вісім тижнів рандомізували для отримання або достатнього вітаміну D (VDS; AIN-93G, D10012G, Дієти дослідницьких, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі) або VDD (модифікований AIN-93G; D1007301, Дієти дослідницьких) дієта (рисунок 2). Окрім вітаміну D, усі поживні речовини, включаючи кальцій та фосфор, забезпечувались у кількості, яка відповідає потребам NRC у поживних речовинах для лабораторних тварин. 51 Миші мали вільний доступ до дієти та води. Під час експерименту з короткочасним опроміненням споживання корму вимірювали шляхом зважування їжі щодня протягом 5 днів поспіль протягом 1 та 8 тижнів. Масу тіла вимірювали на початку та кожні 2 тижні протягом обох експериментів.

Склад поживних речовин та щільність енергії експериментальних дієт.

Короткочасний вплив ВДД.

Сироватку збирали на вихідному рівні та щотижня протягом 4 тижнів (з 1 по 4 тиждень) для визначення 25 (OH) D, паратиреоїдного гормону (PTH) та концентрації кальцію. Відразу після збору на 4-му тижні мишей VDD перевели на дієту VDS, і аналогічним чином збирали сироватку протягом наступних 4 тижнів (з 5 по 8 тиждень) для визначення концентрації 25 (OH) D, PTH і кальцію.

Тривалий вплив ВДД.

У довгостроковому дослідженні вимірювали масу тіла та збирали сироватку на початковому рівні та кожні 2 тижні після цього. Склад тіла з трьома відділеннями (нежирна тканина, жирова тканина та вода) визначали за допомогою ехоМРТ на 40 тижні годування (віком 48 тижнів), безпосередньо перед закінченням дослідження.

Визначення концентрації вітаміну D, кальцію та ПТГ у сироватці крові.

Цільну кров відбирали з підшкірної вени і розподіляли в пробірки для сепарації сироватки (каталожний номер 201308, Сарштедт, Номбрехт, Німеччина), центрифугували відповідно до інструкцій виробників і зберігали при –80 ° C. Через обмежені обсяги сироватки, які можна було зібрати в кожен момент часу, ми чергували, які параметри вимірювали. Концентрацію 25 (OH) D в циркулюючій крові визначали методом ІФА (діапазон виявлення, від 10 до 300 нмоль/л; коефіцієнт варіації внутрішньопробного дослідження, 4,2%; номер каталогу VID21-K02, Eagle Biosciences; Nashua, NH). Концентрацію кальцію в сироватці крові визначали за допомогою колориметричного аналізу (Sigma-Aldrich; St Louis, MO). Концентрацію ПТГ у сироватці крові визначали за допомогою імуноферментного аналізу (діапазон виявлення від 1,47 до 1000 пг/мл; варіаційний коефіцієнт внутрішньоаналізного дослідження, 10%; Sigma – Aldrich).

Статистичний аналіз.

Базові порівняння ваги всього тіла, концентрацій D (OH) D та добового споживання їжі аналізували за допомогою критерію Стьюдента. Порівняння концентрацій 25 (ОН) D та маси тіла у дієтичній групі проводили за допомогою повторних вимірювань ANOVA. Дієта, час та дієта × час взаємодії служили незалежними змінними для аналізів, дозволяючи нам визначити, чи залежав вплив дієти (основний ефект; для будь-якого даного результату) від того, як довго миші були на дієті. У цій моделі час був повторним показником, завдяки чому можна було порівнювати групи лікування у кожний момент часу. Дані представлені як середнє значення ± SEM. Всі аналізи проводились із використанням статистичного програмного забезпечення SAS 9.4 (SAS Software, Cary, NC); значення Р 0,05 або менше вважалося значущим.

Результати

Виснаження та переповнення вітаміну D у самок мишей репродуктивного віку.

На початковому рівні ні маса тіла, ні статус вітаміну D не відрізнялись між групами VDS та VDD (19,3 ± 1,3 г порівняно з 18,8 ± 1,4 г, P = 0,774; таблиця 1). Подібним чином, щоденне споживання корму було подібним між групами VDS та VDD протягом 1 тижня (2,6 ± 0,2 г порівняно з 2,7 ± 0,2 г, Р = 0,73) та 8 тижня (2,9 ± 0,3 г порівняно з 3,0 ± 0,2 г, Р = 0,748; Таблиця 1). Концентрація D у сироватці крові 25 (OH) демонструвала значну кількість (P Рисунок 3 A), однак тижнева зміна концентрації D в сироватці крові 25 (OH) була значною лише між тижнями 2 та 3 дієти VDD (зниження на 28,2 нмоль/л, Р = 0,009). Крім того, різниця між групами в концентрації 25 (OH) D була незначною до 2-го тижня (53,4 ± 11,4 нмоль/л у порівнянні з 79 ± 11,2 нмоль/л, Р = 0,014). Незважаючи на те, що вони мали значно нижчі концентрації 25 (OH) D, ніж група VDS, миші VDD не були VDD відповідно до межі, встановленої Інститутом медицини (тобто 25 (OH) D менше 50 нмоль/л) до тижня 3. Концентрація 25 (OH) D, що циркулює, почала вирівнюватися в групі VDD, з незначним зниженням між 3 та 4 тижнями (зниження 7,5 нмоль/л, P = 0,782). 60

Таблиця 1.

Базова маса тіла, концентрація D (OH) D 25 і середнє споживання їжі

VDS	VDD	P
Вага всього тіла (г)	19,3 ± 1,3	18,8 ± 1,4	0,774
25 (OH) D (нмоль/л)	73,5 ± 11,5	72,0 ± 10,8	0,904
Середньодобове споживання (тиждень 1; г)	2,6 ± 0,2	2,7 ± 0,2	0,730
Середньодобове споживання (тиждень 8; г)	2,9 ± 0,3	3,0 ± 0,2	0,748

VDD, дефіцит вітаміну D; VDS, вітамін D достатній

Дані подані як середні значення ± SEM. Значення P представляють порівняння дієтичних груп за допомогою t-критерію Стьюдента.

Статус вітаміну D у самок мишей репродуктивного віку, які довго піддавались ВДД.

Концентрації D у сироватці крові 25 (OH) на вихідному рівні не відрізнялись між групами VDS та VDD (73,5 ± 11,3 нмоль/л у порівнянні з 71,4 ± 11,4 нмоль/л, P = 0,896; Рисунок 4 A). Концентрація D у сироватці крові 25 (OH) показала значні показники (P Рисунок 4 B). Рівень ПТГ у сироватці крові у групі VDS протягом усього дослідження не змінювався (Р = 0,963). У групі VDD рівень ПТГ у сироватці крові був значно вищим, ніж у групі VDS, починаючи з 2 тижнів (66,2 ± 23,2 пг/мл порівняно з 131,2 ± 24,4, P = 0,024; малюнок 4 B) і залишався значно вищим у кожен наступний час балів. У групі VDD рівень ПТГ у сироватці крові суттєво зріс між 2 та 6 тижнями (збільшення на 50,3 пг/мл, Р = 0,044); протягом останнього періоду дослідження не спостерігалося жодного значного збільшення між тижнями.

Концентрація кальцію в сироватці крові показала значну (Р = 0,041) взаємодію між дієтою та часом (рис. 4 С). Незважаючи на те, що жодна з груп не мала значущих тижневих змін концентрації кальцію в сироватці крові, ці рівні були меншими у мишей, що годувались VDD, ніж у мишей VDS, починаючи з 12 тижня, і тривали протягом усього експерименту.

Крива росту та склад тіла самок мишей репродуктивного віку, які тривалий час піддавались ВДД.

Сироватка 25 (OH) D, гідроксипохідне вітаміну D та функціональний показник стану вітаміну D, має період напіввиведення приблизно від 20 до 30 днів у людини; наше спостереження про те, що для досягнення дефіцитного стану у мишей самок репродуктивного віку знадобилося 3 тижні для концентрацій 25 (OH) D (що падають приблизно на 2 нмоль/л щодня), відповідає цьому звіту. 28 Наші висновки також підкреслюють важливість добре розроблених досліджень, які не тільки забезпечують достатній час для виснаження вітаміну D, але також розглядають можливість незмінної, низької, але стабільної концентрації 25 (OH) D в сироватці крові протягом тривалого часу. Наші дані про гомеостаз кальцію проливають трохи світла на цей рахунок.

Щоб обійти ускладнення для здоров’я, пов’язані з кальциотропними наслідками ВДД, слід розглянути можливість використання дієт з високим вмістом кальцію. Загальноприйнятою практикою є те, що дослідники, які використовують нокаут рецепторів вітаміну D та моделі, що не мають CYP27B1 (фермент, необхідний для активації вітаміну D), використовують “дієти для порятунку”, які підтримують нормальну концентрацію кальцію в крові. 19,36,46 Ці рятувальні дієти збагачені кальцієм (приблизно 2%) і фосфором (приблизно 1,25%) і містять додаткову лактозу для сприяння засвоєнню кальцію. 17,39 Слідчі, які використовують дієтичну модель ВДД, повинні включати рятувальну дієту, щоб запобігти змішуванню результатів.

У поточному дослідженні репродуктивні жіночі миші, які перебувають на дієті VDD, продемонстрували подібні закономірності росту як миші, що годувались VDS, до 26 тижнів, після чого миші VDD почали швидко втрачати вагу. Після закінчення дослідження (40 тижнів дієти; вік 48 тижнів) миші, що годували VDD, важили значно менше, ніж миші VDS. Вимірювання складової тіла ЕхоМРТ (жиру порівняно з відділеннями з нежирною масою тіла) показало, що різниця у масі тіла пояснюється широкими втратами як нежирної, так і жирової тканини. Цей результат не дивно, враховуючи, що рівень кальцію в сироватці крові протягом тривалого періоду опускався нижче 2,0 ммоль/л. Можливо, спостерігається втрата маси зумовлена системною дисрегуляцією та анорексигенними ефектами, пов'язаними з гіпокальціємією; 22 ця гіпотеза вимагає подальшого вивчення, яке включає випробувальну групу, яка отримує кальцієво-рятувальну дієту. В якості альтернативи будь-які припущені анорексигенні ефекти можуть бути пов’язані з гормональними порушеннями, такими як лептин, нейропептид Y або орексин; це питання має бути вирішене в майбутніх дослідженнях. Крім того, подальші дослідження можуть включати сканування рентгенівської абсорбціометрії з подвійною енергією, щоб підтвердити, наскільки велика різниця в м’якій масі пов’язана з мінералом кісткової тканини порівняно з втратою м’язів.

Основним обмеженням обох наших експериментів була неможливість одночасно вимірювати всі аналіти через обмеження кількості сироватки, яку можна було безпечно забрати від мишей. У довгостроковому дослідженні основним обмеженням була відсутність даних про споживання їжі. Без цієї інформації ми не можемо виключити анорексигенні наслідки VDD, що пояснювало б значну втрату ваги у мишей VDD, як це було задокументовано в деяких дослідженнях VDD на людині. 4,65 У майбутніх дослідженнях, що забезпечують дієти з ВДД на тривалій основі, слід вивчити загальне споживання корму та контролювати потенційний вплив на масу тіла. Єдине інше відоме дослідження, яке вивчало довгострокові ефекти VDD у мишей C57BL/6, також не вимірювало споживання їжі. 69

Добре зрозумілими наслідками ВДД у лабораторних тварин, на яких ґрунтуються сучасні рекомендації NRC, є гіпокальціємія та гіперпаратиреоз. 51 Однак, з часу останньої публікації рекомендацій NRC у 1995 р., Ми зрозуміли, що вітамін D відіграє велику роль в організмі і що необхідні тваринні моделі, які рекапітулюють умови, пов'язані з ВДД. 32 Тут ми охарактеризували тимчасовий перебіг як виснаження ВДД, так і переповнення у самок мишей репродуктивного віку. Ці дані допоможуть слідчим у розробці майбутньої роботи, включаючи дослідження, що вивчають потенціал наслідків DOHaD для потомства, що походять від ВДД матері. Наші результати надалі підкреслюють важливість моніторингу та контролю кальціотропних ефектів ВДД, спричинених дієтою, під час вивчення некальциотропних ефектів та підтримку використання гіпокальціємічних рятувальних дієт у довгострокових дослідженнях дієти ВДД. Більше того, ми надаємо докази у репродуктивному віці мишей-самок C57BL/6 про те, що тривалий ВДД призводить до метаболічно значущих змін абсолютного, але не відносного складу тіла (21% зменшення жиру в організмі та 13% втрати сухої маси). Ці ефекти можуть бути важливим фактором при вивченні вітаміну D та метаболізму. 42,57

Подяка

Ця робота фінансувалась кафедрою харчування та фізичної фізкультури Університету Міссурі.