Розширення ксилозилу O-глюкозних гліканів на позаклітинному домені NOTCH1 та NOTCH2 регулює торгівлю поверхнею клітинної поверхні

Ідентифікація O-глюкозильованого пептиду з EGF2 з NOTCH1 за допомогою LC-MS/MS. Білок NOTCH1 EGF1-18 вироблявся в клітинах дикого типу HEK293T і очищався з культурального середовища, як описано в Матеріалах і Методах. Білок відновлювали, алкілювали та очищали за допомогою SDS-PAGE і піддавали перетравленню в гелі трипсину. Отримані пептиди аналізували за допомогою LC-MS/MS, як описано в Матеріали та методи. (A) На верхній панелі показано спектр MS від 23,8 до 24,0 хв. На нижній панелі показано спектр MS/MS глікопептиду з EGF2, модифікованого трисахаридом Xyl-Xyl-Glc. Червоний діамант позначає батьківський іон. Численні іони b- та y підтвердили ідентичність пептиду 57-CQDSNPCLSTPCK-69 від NOTCH1. (B) Показані екстраговані іонні хроматограми (EIC), які шукали глікопептиди, модифіковані різними глікоформами. (C) Кількісну оцінку проводили з використанням висоти EIC виявлених іонів та загальної кількості виявлених (гліко) пептидів з різними глікоформами, встановлених на рівні 100% (n = 3). На панелі помилок відображається стандартна помилка середнього значення. Чорна смужка — голий пептид; синій круг — глюкоза; помаранчева зірка — ксилоза.

Повтори EGF з NOTCH2 модифіковані трисахаридами O-Glc. Мас-спектрометричний аналіз гліканів O -Glc на мишах NOTCH2, продукованих у клітинах HEK293T. Зразки генерували в контрольних клітинах дикого типу HEK293T, клітинах GKO GXYLT1/2 і клітинах XXYLT1 KO, трансфікованих плазмідами, що кодують позаклітинні домени миші NOTCH2 (ECD), як описано в експериментальних процедурах. Дані отримані в результаті аналізу миші NOTCH2 EGF1-36. Спектри MS/MS підтвердили ідентичність (гліко) пептидів на основі присутності пептид-специфічних b- та y-іонів та нейтральної втрати передбачуваних гліканів. Спектри MS/MS показані на малюнку S2. Послідовність пептидів, передбачувана та виміряна маса (m/z) та зарядний стан зведені в таблицю S2. Кількісну оцінку проводили з використанням висоти EIC, і загальна кількість виявлених (гліко) пептидів з різними глікоформами встановлюється на рівні 100%. Дані отримані принаймні з двох біологічних копій. Детальніше наведено в таблиці S2. Кольорові літери в послідовностях таблиці показують передбачувані сайти посттрансляційних модифікацій. Синій— O -Glc; червоний— O -Fuc; зелений— O -GlcNAc; жовтий— N -глікан; фіолетовий - β-гідроксилювання.

XYLT не потрібні для експресії на поверхні клітин ендогенних NOTCH1 та NOTCH2 у клітинах HEK293T. (А) Гістограми ендогенної експресії NOTCH1 у клонах дикого типу та KO XYLTs клітин HEK293T, проаналізованих за допомогою проточної цитометрії. (B) Середня інтенсивність флуоресценції від (A). Сюжети взяті з трьох незалежних експериментів (n = 3). Панель помилок позначає стандартну помилку середнього значення (SEM). Гістограми показують середнє значення ± SEM. (C) Гістограми ендогенної експресії NOTCH2 у клонах дикого типу та KO XYLTs клітин HEK293T, проаналізованих за допомогою проточної цитометрії. (D) Середня інтенсивність флуоресценції від (C). Сюжети взяті з трьох незалежних експериментів (n = 3). Гістограми показують середнє значення ± SEM. Номери комірок на вертикальній осі графіків для (A, C) нормуються зі значенням режиму. n.s., незначне (p> 0,05).

Подовження ксилозилу O -Glc гліканів посилює секрецію ECDs NOTCH1 та NOTCH2, надмірно експресованих у клітинах HEK293T. (A) Аналіз секреції з міченою Myc-His6 версією EGF1–36 з NOTCH1 (N1 EGF1–36) у контролі дикого типу та клонах KO XYLTs. Білки N1 EGF1–36 у культуральному середовищі та клітинних лізатах виявляли вестерн-блот, використовуючи антитіло до Myc. EV, порожній вектор; N1, NOTCH1; G1, GXYLT1; G2; GXYLT2, X1; XXYLT1. Показано репрезентативне зображення трьох незалежних експериментів. (B) Вказано відносну інтенсивність білків N1 EGF1–36. Сюжети взяті з трьох незалежних експериментів (n = 3). Гістограми показують середнє значення ± SEM. * р В) Аналіз секреції з міченою Myc-His6 версією EGF1–36 з NOTCH2 (N2 EGF1–36) у контролі дикого типу та клонах KO XYLTs. Білки N2 EGF1–36 у культуральних середовищах та клітинних лізатах виявляли вестерн-блот, використовуючи анти-Myc антитіло. EV, порожній вектор; N1, NOTCH1; G1, GXYLT1; G2; GXYLT2, X1; XXYLT1. Показано репрезентативне зображення трьох незалежних експериментів. (D) Вказано відносну інтенсивність білків N2 EGF1–36. Сюжети взяті з трьох незалежних експериментів (n = 3). Гістограми показують середнє значення ± SEM. Неопрацьовані дані доступні на малюнку S8. *, p p ≥ 0,05).

Потенційна роль ксилозилового розширення гліканів O -Glc у контролі якості NOTCH1 та NOTCH2. (A) Вирівнювання послідовності всіх 17 повторів EGF людини та миші NOTCH1 (лівий стовпець) та NOTCH2 (правий стовпець), що містять консенсусну послідовність O -Glc з повторенням EGF 1 від людського фактора IX (hFA9). Місце модифікації O -Glc у послідовності консенсусу виділено чорним кольором та позначено синім колом. Шість збережених залишків цистеїну виділено жовтим кольором. Показано, що трисахарид O -Glc взаємодіє внутрішньомолекулярно з гідрофобною областю, утвореною проліном 55 та тирозином 69, у повторі EGF hFA9 (17). Відповідні позиції виділені зеленим кольором. (B) Схематичне представлення ефектів втрати XYLT на експресію на поверхні клітини NOTCH1 та NOTCH2. Втрата XYLT в клітинах HEK293T не спричиняла жодних змін у експресії поверхні клітин ендогенних NOTCH1 та NOTCH2 (зверху). При надмірному вираженні NOTCH1 та NOTCH2 втрата як GXYLT1, так і GXYLT2 суттєво зменшила експресію їх клітинної поверхні, тоді як втрата XXYLT1 показала більш м'який, але істотний ефект (знизу).

Анотація

Ідентифікація O- глюкозильованого пептиду з EGF2 з NOTCH1 за допомогою LC-MS/MS. Білок NOTCH1 EGF1-18 вироблявся в клітинах дикого типу HEK293T і очищався з культурального середовища, як описано в Матеріалах і Методах. Білок відновлювали, алкілювали та очищали за допомогою SDS-PAGE і піддавали перетравленню в гелі трипсину. Отримані пептиди аналізували за допомогою LC-MS/MS, як описано в Матеріали та методи. (A) На верхній панелі показано спектр MS від 23,8 до 24,0 хв. На нижній панелі показано спектр MS/MS глікопептиду з EGF2, модифікованого трисахаридом Xyl-Xyl-Glc. Червоний діамант позначає батьківський іон. Численні іони b- та y підтвердили ідентичність пептиду 57-CQDSNPCLSTPCK-69 від NOTCH1. (B) Показані екстраговані іонні хроматограми (EIC), які шукали глікопептиди, модифіковані різними глікоформами. (C) Кількісну оцінку проводили з використанням висоти EIC виявлених іонів та загальної кількості виявлених (гліко) пептидів з різними глікоформами, встановлених на рівні 100% (n = 3). На панелі помилок відображається стандартна помилка середнього значення. Чорна смужка — голий пептид; синій круг — глюкоза; помаранчева зірка — ксилоза.

Повтори EGF з NOTCH2 модифіковані трисахаридами O-Glc. Мас-спектрометричний аналіз O -Glc гліканів на мишах NOTCH2, продукованих у клітинах HEK293T. Зразки генерували в контрольних клітинах дикого типу HEK293T, клітинах GKO GXYLT1/2 DKO та клітинах XXYLT1 KO, трансфікованих плазмідами, що кодують позаклітинні домени миші NOTCH2 (ECD), як описано в експериментальних процедурах. Дані отримані в результаті аналізу миші NOTCH2 EGF1-36. Спектри MS/MS підтвердили ідентичність (гліко) пептидів на основі присутності пептид-специфічних b- та y-іонів та нейтральної втрати передбачуваних гліканів. Спектри MS/MS показані на малюнку S2. Послідовність пептидів, передбачувана та виміряна маса (m/z) та зарядний стан зведені в таблицю S2. Кількісну оцінку проводили з використанням висоти EIC, і загальна кількість виявлених (гліко) пептидів з різними глікоформами встановлюється на рівні 100%. Дані отримані принаймні з двох біологічних копій. Детальніше наведено в таблиці S2. Кольорові літери в послідовностях таблиці показують передбачувані сайти посттрансляційних модифікацій. Синій— O -Glc; червоний— O -Fuc; зелений— O -GlcNAc; жовтий— N -глікан; фіолетовий - β-гідроксилювання.