Амінокислоти з розгалуженими ланцюгами посилюють порушення функції печінкової глюкози та ліпідів, пов’язані з ожирінням через послаблення сигналізації Akt2

H.Z. та Ф.З. внесли однаковий внесок у цю роботу.

Анотація

Вступ

Ожиріння та пов'язані з цим метаболічні захворювання, такі як резистентність до інсуліну та цукровий діабет 2 типу (T2DM), стали основними проблемами здоров'я у всьому світі (1). Ожиріння пов'язане зі збільшенням накопичення ліпідів у позаматкових тканинах, таких як печінка, скелетні м'язи та нирки (2). Ектопічне накопичення ліпідів у печінці відоме як неалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) і тісно пов'язане з резистентністю до інсуліну (3). НАЖХП можна розділити на простий стеатоз та неалкогольний стеатогепатит (НАСГ). Як відомо, печінковий жир зменшується з прогресуванням НАСГ, який був названий спаленим НАСГ (4). Це явище стосується зміненого метаболізму ліпідів у печінці з прогресуванням НАЖХП, але пов'язані механізми залишаються невідомими.

Дієтичні вуглеводи та жири причинно пов’язані з розвитком резистентності до інсуліну (11). Хоча небезпечні ефекти високого вмісту глюкози та високого вмісту жиру (HF) на метаболічний гомеостаз печінки добре відомі, вплив високого споживання білка на пов'язані з ожирінням порушення метаболізму залишається незрозумілим. BCAA (лейцин, ізолейцин та валін) - це група незамінних амінокислот. Відносно багато в їжі, вони становлять 15-25% від загального споживання білка (13). Недавні дослідження показують, що BCAA пов'язані з розвитком T2DM (14) та NAFLD (11). Примітно, що підвищені концентрації BCAA в циркуляції сильно прогнозують ризик розвитку T2DM (15). Орієнтація на катаболізм BCAA є потенційною стратегією лікування інсулінорезистентності, пов’язаної з ожирінням (16). Разом ці клінічні дослідження припускають, що BCAA можуть мати негативний вплив на метаболічний гомеостаз печінки, особливо в резистентних до інсуліну станах. Однак чи не підвищений вміст BCAA відіграє причинну роль у порушенні печінкового метаболізму глюкози та ліпідів, залишається невстановленим.

Тут ми прагнемо з’ясувати роль BCAA у метаболізмі глюкози та ліпідів у печінці та сприяти розвитку інсулінорезистентності до важких станів та системних порушень метаболізму глюкози та ліпідів, а також додатково визначити значення та з’ясувати основні механізми.

Дизайн та методи дослідження

Тварини

Усі експерименти на тваринах проводились відповідно до рекомендацій Національного інституту охорони здоров’я на лабораторних тваринах та були затверджені Комітетом з догляду та використання ВВС Військово-медичних сил. Дорослих самців мишей дикого типу C57BL/6J було придбано у Центрі тварин Військово-медичного університету Військово-повітряних сил. Усі миші були вирощені в приміщенні з контролем температури і підтримувались на тлі 26 ± 2 ° C і 55 ± 15% відносної вологості з постійним 12-годинним циклом світло/темрява.

Мишей дикого типу C57BL/6J випадковим чином розподіляли на чотири групи: групу, яка годувалась нормальною дієтою (ND), групу, яку годували раціоном HF, групу HF плюс BCAA (HF/BCAA) та групу HF/парних в якому споживання калорій відповідало такому для групи HF/BCAA. Всіх мишей годували протягом 16 тижнів із вільним доступом до води або їжі. Вагу тіла та споживання їжі контролювали кожні 3 дні та розраховували як ккал/г/тиждень. Аденоасоційований вірус серотипу-9 (AAV9) -myr-Akt2 з широким промотором цитомегаловірусу доставлявся через ін'єкцію хвостової вени, і кожній миші вводили 1,2 × 10 11 векторів або геномів. Послідовність myr - atggggagcagcaagagcaagcccaagtctaga.

Мишей евтаназували ізофлураном. Кров збирали через сонну артерію. Тканини збирали після жертвоприношення тварин і негайно заморожували в рідкому азоті. Для досліджень, які проводили натощак, мишей голодували протягом ночі, а потім годували протягом 6 годин.

ВЧ дієтичне годування

Протоколи парного годування виконувались, як описано раніше (17). Щоб провести аналіз парного вигодовування, ми спочатку визначили загальну масу тіла групи HF/BCAA (A g) і підрахували загальну кількість споживаних калорій (B) щодня (B = [загальна кількість калорій - калорії в з’їденій їжі]/день) та споживаних калорій на день залежно від рівня BCAA у питній воді (C кал). Потім ми визначили спожиті калорії на грам маси тіла (D кал/г) = (В [кал] + С [кал])/загальна вага тіла (А г). Далі ми виміряли загальну масу тіла (Е г) СН та парної групи та розрахували кількість ВЧ дієтичної їжі, яку слід вводити ВЧ/парній групі (F кал.) (F = D ∗ E), наступним чином день. Загальну їжу розподіляли на дві порції та забезпечували її в окремий час (8:00 та 18:00), щоб уникнути голоду. ВЧ/парній групі була надана 60% СН-дієта без ВСАА.

Дієти, що використовуються в цьому дослідженні

ВЧ-дієта (60% ккал від жиру, D12492) використовувалася для індукції асоційованої з ожирінням резистентності до інсуліну, як повідомлялося раніше (18), а НД (10% ккал від жиру, D12450) використовувалася як НД, яку годували до контрольної групи. Обидві страви були придбані у Research Diets. BCAA (4%) розчиняли у питній воді при співвідношенні лейцин-ізолейцин-валін 2: 1: 1 (19).

Метаболічні дослідження

Тести на толерантність до глюкози (GTT) та тести на толерантність до інсуліну (ITT) проводили, як повідомлялося раніше (20). Мишам вводили внутрішньоочеревинно людський інсулін (Eli Lilly) при 0,75 МО/г маси тіла або 20% глюкози при 2,0 мг/г маси тіла після позбавлення їжі протягом ночі. Глюкозу в крові вимірювали через 0, 15, 30, 60, 90 та 120 хв після ін’єкції.

Тест на толерантність до пірувату

Миші голодували протягом 16 год перед внутрішньочеревною ін'єкцією пірувату натрію (2 г/кг маси тіла). Глюкозу в плазмі крові вимірювали через 0, 15, 30, 60, 90 та 120 хв після ін’єкції, а проби крові відбирали з хвостової вени.

Первинні культури гепатоцитів

Первинні гепатоцити виділяли у 8-10-тижневих дорослих самців мишей WT C57BL/6J. Виділення гепатоцитів проводили за допомогою двоступеневого методу перфузії колагенази, як повідомлялося раніше (21). Коротко кажучи, перфузія через печінкову ворітну вену послідовно розпочиналася 40 мл PBS, 20 мл розчину D-Hanks, що містить 0,1 ммоль/л ЕДТА, і 40 мл 0,05% розчину колагенази IV типу. Печінку видаляли хірургічним шляхом, а первинні гепатоцити висівали в посуд, покритий колагеном I. Первинна життєздатність гепатоцитів, оцінена за виключенням трипанового синього, становила> 90%.

Зараження аденовірусом (Vector Biolabs) проводили через 6 год після посіву (кратність зараження 10). Через 6 годин зараження клітини двічі промивали PBS і сироватку голодували протягом ночі перед стимуляцією інсуліном. Нецільовий контроль та siRNA INSIG2 або Mul1 siRNA були тимчасово трансфіковані в первинні гепатоцити через 6 год після нанесення ліпофектаміном 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Через 24 години після трансфекції клітини голодували протягом ночі перед стимуляцією інсуліном. Послідовності INSIG2-siРНК були такими: CGGUGUUCGUGGGUAUAAATT (сенсовий ланцюг) і UUUAUACCCACGAACACCGTT (антисмисловий ланцюг). Послідовності Mul1-siРНК були такими: GCGAGAGGCCCAAAGGCAUTT (сенсовий ланцюг) і AUGCCUUUGGGCCUCUCGCTT (антисмисловий ланцюг).

Аналіз виробництва глюкози in vitro

Тести на продукцію глюкози в первинних гепатоцитах проводили, як описано раніше (11). Гепатоцити голодували через сироватку протягом 24 годин і замінювали середовищем для виробництва глюкози та інкубували протягом 5 годин з носієм, 100 мкмоль/л 8-CPT – cAMP (Sigma-Aldrich), або cAMP плюс 10 нмоль/л інсуліну. Рівні глюкози в культуральному середовищі визначали за допомогою аналізу пероксидаза-глюкозооксидаза (Sigma-Aldrich) і нормалізували до рівня білка в тій же лунці. Для групи лікування Aktviii Aktviii додавали в безсироваткове середовище за 30 хв до лікування інсуліном або носія. Додаткові клітини використовували для визначення експресії ключових генів, що контролюють глюконеогенез.

Імуноблотинг

Готували лізати з тканини печінки миші та первинних гепатоцитів. Загальний білок із тканини печінки та первинних гепатоцитів виділяли за допомогою буфера лізису для аналізу радіоімунопреципітації (Beyotime, Шанхай, Китай) з інгібіторами протеази та фосфатази. Концентрацію білка визначали кількісно за допомогою набору для аналізу білків біцинхонінової кислоти (Beyotime). Білкові екстракти відокремлювали за допомогою SDS-PAGE, переносили їх у мембрани нітроцелюлози (Millipore) та інкубували із зазначеними антитілами (перераховані в додатковій таблиці 1) з подальшою інкубацією кон’югованих з пероксидазою хрону вторинних антитіл. Антитіла розводили 1: 1000 у сольовому розчині, забуференному Тріс. Смуги були виявлені за допомогою підвісного хемілюмінесцентного пероксидазного хрону Immobilon Western (Millipore) та зображені за допомогою систем візуалізації ChemiDoc (Bio-Rad). β-актин служив контролем для нормалізації експресії білка.

Коиммунопреципітація

Клітини в шестилункових планшетах промивали три рази PBS і лізували в холодному крижаному радіоімунопреципітаційному аналізі буфера лізису інгібіторами протеази/фосфатази. Лізати інкубували на льоду протягом 30 хв, а потім центрифугували при 12000 г протягом 15 хв. Супернатанти інкубували з первинними антитілами протягом 12 годин при 4 ° C. Після цього до зразків додавали суспензію протеїну G Dynabeads G (Life Technologies) та інкубували при 4 ° C протягом 2 годин. Імунопреципітовані білки елюювали, денатурували і кип'ятили протягом 5 хв для вестерн-блот.

Аналіз експресії генів

Для аналізу експресії генів загальну РНК з первинних гепатоцитів і тканини печінки екстрагували за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen). кДНК синтезували за допомогою набору РНК-ПЛР (Takara Bio, Shiga, Японія) відповідно до вказівок виробника. Кількісну ПЛР в реальному часі на основі SYBR проводили із використанням ПЛР в реальному часі Applied Biosystems 7300. Триразові зразки відбирали для кожної обробки. Відносні значення експресії розраховували як відношення цільової кДНК до β-актину. Всі дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 7. Послідовності пар праймерів наведені в додатковій таблиці 1.