Адипогенез при ожирінні вимагає тісної взаємодії між диференціюючими адипоцитами, стромальними клітинами та кровоносними судинами

Анотація

ЦІЛЬ - Розширення маси жирової тканини, яке спостерігається при ожирінні, включає як гіперплазію, так і гіпертрофію адипоцитів. Однак мало відомо про те, як адипоцити, попередники адипоцитів, кровоносні судини та стромальні клітини взаємодіють між собою для досягнення адипогенезу.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ - Ми розробили метод конфокальної мікроскопії тривимірної візуалізації інтактної живої жирової тканини, що дозволило нам одночасно оцінити ангіогенез та адипогенез у мишей db/db.

РЕЗУЛЬТАТИ - Ми виявили, що диференціація адипоцитів відбувається в клітинних кластерах (які ми назвали адіпогенними/ангіогенними клітинними кластерами), які містять кілька типів клітин, включаючи ендотеліальні клітини та стромальні клітини, які експресують CD34 та CD68 та зв'язують лектин. Існували тісні просторові та часові взаємозв'язки між утворенням кровоносних судин та адипогенезом, і проростання нових судин із існуючої судинної системи було пов'язане з диференціацією адипоцитів. CD34 + CD68 + лектинзв'язуючі клітини можна було чітко відрізнити від CD34 - CD68 + макрофагів, які були розсіяні в стромі і не зв'язували лектин. Адипогенні/ангіогенні скупчення клітин можна морфологічно та імуногістохімічно відрізнити від коронкоподібних структур, які часто спостерігаються на пізніх стадіях ожиріння жирової тканини. Введення антитіл проти судинного ендотеліального фактора росту (VEGF) пригнічувало не тільки ангіогенез, але й утворення адипогенних/ангіогенних кластерних клітин, вказуючи на те, що зв'язок адипогенезу та ангіогенезу є важливим для диференціації адипоцитів при ожирінні і що VEGF є ключовим медіатором цього процесу.

ВИСНОВКИ - Методи візуалізації живої тканини дають нові докази динамічної взаємодії між диференціюючими адипоцитами, стромальними клітинами та ангіогенезом у жировій жировій жировій тканині.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Розширена версія розділу проектування та методів дослідження доступна в Інтернет-додатку «Матеріали та методи» (доступний за адресою http://dx.doi.org/10.2337/db06-1749).

Візуалізація живої тканини.

8-тижневих мишей db/db розділили на дві групи: групу db/db + фактор росту судинного ендотеліального фактора (VEGF) (якій підшкірно вводили моноклональне антитіло проти VEGF [100 мкг/мишу] протягом 2 років. тижнів до експерименту) та контрольної групи db/db (яка отримувала неспецифічний IgG).

Мишей вбивали вивихом шийки матки, після чого епідидимальний жир видаляли стерильними методами та подрібнювали на невеликі шматочки (~ 2–3 мм) за допомогою скальпеля. Потім шматочки тканини промивали та інкубували з FM1-43, BODIPY, ацетильованим ЛПНЩ, кон'югованим з Alexa Fluor, або ізолектином Griffonia simplicifolia GS-IB4, кон'югованим з Alexa Fluor. Ядра були забруднені Hoechst 33342.

Як повідомляється, ізолектин Griffonia simplicifolia IB4 є корисним гістохімічним зондом, який специфічно позначає ендотеліальні клітини багатьох видів та тканин, включаючи жирову тканину (19). Ми підтвердили ці висновки подвійним фарбуванням жирової тканини анти-CD31 (молекула адгезії тромбоцитів/ендотеліальних клітин) та лектином, що дало однакові схеми фарбування (Інтернет-додаток, рис. 1).

Всі експерименти були схвалені Комітетом етики університетів Токіо для експериментів на тваринах і суворо дотримувались рекомендацій щодо експериментів на тваринах Токійського університету.

Конфокальна мікроскопія.

Використовували конфокальний лазерний скануючий мікроскоп (CSU22; Yokogawa-denki та LSM510 Meta; Carl Zeiss). Тканину збуджували за допомогою різнокольорових лазерних ліній, і випромінювання збирали через відповідні вузькосмугові фільтри. Кожне зображення створювалось із середнього восьми кадрів, після чого отримані зображення оброблялись, щоб отримати тривимірну модель, відтворену поверхнею.

Використовуючи останнє, ми підтвердили, що кожен адипоцит в жировій тканині оточений мікросудинами з використанням штабелів товщиною 50 мкм, але нам було важко візуалізувати точні деталі структур через недостатнє фокусування на глибоких зрізах. Тому ми вирішили використовувати переважно стоси + клітин без порушення плазматичної мембрани. Показана гістограма була побудована з 1000 клітин з кожної групи. Для обчислення кількості адипоцитів в епідидимальних жирових прокладках об'єм жиру ділили на визначену кількість клітин на одиницю об'єму.

Для кількісної оцінки кількості адипогенних кластерних клітин з кожних рівних просторових інтервалів брали чотири зрізи з кожної жирової прокладки епідидимуму, а для кожного зрізу досліджували зображення п’яти полів малої потужності, забарвлених BODIPY та лектином. У кожній групі аналізували чотирьох тварин (загалом 80 полів малої потужності для кожної групи). Було визначено кількість адипогенних/ангіогенних кластерних клітин (що визначається наявністю невеликих адипоцитів, оточених лектинзв'язуючими клітинами та судинами). Ми проаналізували принаймні п’ять полів на зріз та чотири зрізи на жирову масу, щоб отримати репрезентативні зображення.

У попередніх експериментах ми підтвердили, що жирова тканина була структурно однорідною, досліджуючи жирові прокладки з рівними просторовими інтервалами в db/+, а скупчення адипогенних клітин також були однорідно розподілені по всіх зрізах, взятих з різних частин епідидимальних жирових прокладок db/db миші (Інтернет-додаток Рис. 3).

Імунофлуоресцентне фарбування включеного бромодезоксиуридину.

Мишам внутрішньочеревно вводили бромодезоксиуридин (BrdU) (30 мг/кг маси тіла) за 2 дні до вбивства. Після цього резектована жирова тканина була зафіксована, пронизана, оброблена дезоксирибонуклеазою та інкубована з кон’югованими з флуоресцеїном ізотіоціанатом антитілами до BrdU.

Імуногістохімія.

Для імуногістохімічного аналізу ізольовані шматочки тканини фіксували у 4% формальдегіді та просочували 1% Triton X-100. Потім зразки блокували 1% BSA та інкубували з парою первинних антитіл, а потім із вторинним антитілом. Антитіла, барвники, постачальники, час інкубації та концентрація, використані в цьому дослідженні, зведені в таблиці додатків в Інтернеті.

Статистика.

Результати виражаються як середні значення ± SEM. Статистичну значимість відмінностей між двома групами визначали за допомогою t-критеріїв Стьюдента; відмінності між трьома групами оцінювали за допомогою тестів ANOVA та post hoc Бонферроні. Значення Р 6 проти 1,71 ± 0,10 × 10 6 клітин/жирової прокладки відповідно; n = 5 тварин, клітини Р + сильно забарвлені на периліпін (рис. 4В та 5), який є асоційованим з адипоцитами ліпідним крапельним білком, експресія якого індукується під час диференціації адипоцитів від преадипоцитів (21). Сінті та ін. (22) показали, що відмираючі адипоцити негативно впливають на периліпін. 4) Ми не спостерігали жодного фарбування маркерів мертвих клітин у малих BODIPY-позитивних клітинах (Інтернет-додаток, рис. 5). 5) Голодування протягом 24 год не спричинило скупчення клітин, що містять малі адипоцити та навколишні клітини лектин + (Інтернет-додаток, рис. 6).

Зв’язаний ангіогенез важливий для адипогенезу при ожирінні.

Для подальшої характеристики поверхневого фенотипу лектинзв'язуючих клітин в адипогенних/ангіогенних клітинних кластерах ми дослідили їх потрійним фарбуванням для поверхневих маркерів CD31 (молекула адгезії клітин тромбоцитів/ендотеліальних клітин 1, маркер клітин ендотелію), F4/80 ( маркер макрофагів) та периліпін (маркер адипоцитів). Малі пов'язані з адипоцитами лектинзв'язуючі клітини коекспресували CD68 та F4/80 (Інтернет-додаток, рис. 10), а при потрійному фарбуванні на CD31, F4/80 та периліпін F4/80 + малі клітини, асоційовані з адипоцитами, також були позитивними на CD31 (рис. 5S). На відміну від цього, ендотеліальні клітини CD31 + у капілярах ніколи не були позитивними щодо F4/80. Оскільки клітини F4/80 + були негативними щодо периліпіну, це свідчить про те, що вони не були адипоцитами. Таким чином, в жировій тканині з ожирінням було принаймні дві окремі популяції лектинзв’язуючих клітин: CD31 + CD68 - F4/80 - ендотеліальні клітини, що складали кровоносні судини, та клітини CD31 + CD68 + F4/80 +, які оточували малі диференціюючі адипоцити. Характеристики лектинзв'язуючих клітин, стромальних макрофагів, ендотеліальних клітин та адипоцитів у жировій тканині зведені в таблицю 1.

Адипогенні/ангіогенні кластерні клітини морфологічно та імуногістохімічно відрізняються від коронкоподібних структур.

У 8-тижневих мишей db/db переважна більшість клітинних кластерів складалася з адипогенних/ангіогенних клітин (рис. 6). Кількість адипогенних/ангіогенних кластерних клітин зменшилась у 12-тижневих мишей db/db, і короноподібні структури співіснували з ними. У 30-тижневих мишей db/db було виявлено дуже мало адипогенних/ангіогенних кластерних клітин, тоді як спостерігався ряд коронкоподібних структур, що вказує на те, що на пізніх стадіях ожиріння у жировій структурі часто відбувається формування кроноподібної структури тканини (22). Крім того, адипогенні/ангіогенні кластерні клітини є основним механізмом гіперплазії адипоцитів на ранніх стадіях ожиріння (рис. 6Е).

ОБГОВОРЕННЯ

Незважаючи на детальні знання про молекулярні механізми, які контролюють диференціацію адипоцитів in vitro, мало відомо про те, як прогресує адипогенез in vivo, особливо при ожирінні. Наша візуалізація живих клітин показала, що адипогенез відбувається в межах адипогенних/ангіогенних клітинних скупчень, які також містять різні стромальні клітини та судини, і що ангіогенез є важливою частиною адипогенезу при ожирінні.

Наші результати демонструють два типи клітин CD68 +: CD34 + CD68 + клітини, пов'язані з малими диференціюючими адипоцитами, та CD34 - CD68 + макрофаги, розсіяні в стромі. Хоча обидві клітинні популяції є CD68 + та F4/80 +, вони можуть представляти різні лінії клітин (табл. 1). Дійсно, фенотип, що включає експресію CD34 та CD68, зв’язування лектину та поглинання ацетильованого ЛПНЩ, відповідає фенотипам обох ендотеліальних клітин, що перебувають у ангіогенезі, та клітин-попередників ендотелію (29). Однак CD34 + CD68 + лектинзв'язуючі клітини не були знайдені в кровоносних судинах і не виявляли морфологічних характеристик ендотеліальних клітин. Таким чином, функція та лінія цих клітин CD34 + CD68 + наразі невідомі. Але, беручи до уваги результати нещодавніх досліджень, які показують, що жирова тканина містить мультипотентні стовбурові клітини (9), спокусливо припустити, що клітини CD34 + CD68 + можуть диференціюватися на ендотеліальні клітини та/або інші типи клітин. Як варіант, вони можуть підтримувати розвиток малих адипоцитів та ангіогенез. Виробництво VEGF у цих клітинах може підтвердити цю гіпотезу. Подальші дослідження, безумовно, потребують подальшої характеристики лінії та функції клітин CD34 + CD68 +.

Наші зображення жирових клітин жирової тканини також виявили тісний просторовий і часовий взаємозв'язок між ангіогенезом і адипогенезом. Цей висновок узгоджується з результатами попередніх досліджень, які показали, що пригнічення ангіогенезу зменшує масу жирової тканини та покращує ожиріння та резистентність до інсуліну (13–16), хоча ці дослідження не з’ясували, як пригнічення ангіогенезу призводить до зменшення маси жиру. Дослідження розвитку жирової тканини також показали, що ангіогенез передує адипогенезу у ембріонів (35). Однак незрозуміло, як взаємодіють ангіогенез та адипогенез і яку роль відіграють кровоносні судини в адипогенезі при ожирінні. Наші сучасні висновки чітко показують, що проростання кровоносних судин активно триває поблизу скупчень диференціюючих адипоцитів та асоційованих з адипоцитами клітин CD34 + CD68 + (рис. 5). Більше того, введення анти-VEGF пригнічувало не тільки ангіогенез, але й адипогенез (рис. 1 і 2), що дає прямі докази того, що ангіогенез є важливим для адипогенезу при ожирінні.

Більш ранні дослідження також показали, що під час постнатального розвитку експресія VEGF в жировій тканині корелює з вагою жиру (36). Наші нинішні висновки проливають світло на механізм впливу VEGF на ріст жирової тканини. На додаток до пригнічення ангіогенезу, введення анти-VEGF також пригнічувало накопичення клітин CD34 + CD68 +, тим самим пригнічуючи утворення адипогенних/ангіогенних кластерних клітин (рис. 5). Таким чином, цілком ймовірно, що VEGF опосередковує початкові взаємодії між судинами, клітинами CD34 + CD68 + та попередниками адипоцитів. Той факт, що рецептор VEGF-1 необхідний для вербування попередників кровотворення та міграції моноцитів та макрофагів (37,38), підтверджує цю модель. Більше того, Fukumura et al. (16) нещодавно повідомляли, що середовище, кондиціоноване ендотеліальними клітинами, містить VEGF і прискорює диференціацію адипоцитів, тоді як лікування антитілом, що блокує рецептор 2 VEGF, пригнічує диференціацію адипоцитів. Таким чином, спокусливо припустити, що асоційовані з адипоцитами клітини CD34 + CD68 + не тільки прискорюють ангіогенез, але й підтримують та сприяють диференціації преадипоцитів за допомогою паракринних взаємодій (39–41).

Представлені зв'язаний адипогенез та ангіогенез у живій жировій тканині. Незакріплена жива жирова тканина від 8-тижневих контрольних мишей db/+ (A і B), контрольних мишей db/db, оброблених IgG (C), мишей db/db, оброблених анти-VEGF (D), і 30 тижнів -старші миші db/db (E) позначали або FM1-43 (A), або лектином (червоним) для ендотеліальних клітин, і BODIPY (синім) для жирних кислот (B – E). У жировій тканині 8-тижневих мишей db/db з’явилася низка дрібних клітин BODIPY +, оточених лектином + клітинами, які не утворювали капілярної структури. Зауважимо, що в жировій тканині 30-тижневих мишей db/db часто спостерігали коронкоподібні структури (E; також посилання на рис. 6), тоді як було виявлено дуже мало адипогенних/ангіогенних скупчень клітин. При подвійному фарбуванні для BODIPY та лектину коронкоподібні структури характеризувались скупченнями лектину - макрофагів, що поглинають BODIPY, які, здавалося, не пов’язані з проростанням кровоносних судин (C проти E). Після введення антитіла проти VEGF ангіогенез пригнічувався, а кількість менших адипоцитів помітно знижувалась (C проти D). Стовпчики являють собою 100 мкм Z-стеки; 10 мкм (A) та 5 мкм (B – E).

Адіпогенні/ангіогенні кластери клітин, що візуалізуються за допомогою зображень живої тканини. Нефіксована жирова тканина мишей db/db віком 8 тижнів була позначена комбінацією лектину (червоний) (A – F), BODIPY (синій) (A – C), ацетильованого LDL (синій) (D – F) та Hoechst 33342 (зелений) (A – F). Зображення представляють різні стадії від міграції периваскулярних лектину + клітин, що оточують малі адипоцити (A і D), до кровоносних судин, що проростають (B, C, E та F) із існуючої судинної системи. Кінчик проростаючої посудини добре видно (стрілки в B, E та F). Вид збоку тривимірного реконструйованого зображення також демонструє глухий кут паростка судини (F). Масштабні смуги представляють 20-мкм, 30-мкм (A і C – E), 4-мкм (B) та 40-мкм Z-стеки.

Характеристика клітин жирової тканини із ожирінням