Адипоцитарні ліпази та дефект ліполізу при ожирінні людини

Анотація

ATGL, жирова тригліцеридна ліпаза
BAY, 4-ізопропіл-3-метил-2- [1- (3- (S) -метил-піперидин-1-іл) -метаноїл] -2Н-ізоксазол-5–1
FFA, вільна жирна кислота
HSL, гормоночутлива ліпаза
KRBA, бікарбонатний буфер Кребса-Рінгера, що містить альбумін
МОМ, 1 (3) -моноолеоїл-2-0-моноолеїл гліцерин

Ожиріння, яке характеризується надлишком жирових запасів, є найважливішим фактором ризику розвитку діабету 2 типу. Ліполіз жирової тканини призводить до гідролізу тригліцеридів і вивільнення вільних жирних кислот (СЖК). Через зв’язок між підвищеним рівнем FFA у циркуляції крові та розвитком резистентності до інсуліну та метаболічним синдромом (1,2) ліполіз жирової тканини є ціллю для фармацевтичної промисловості. Нікотинова кислота, яка діє, пригнічуючи ліполіз жирової тканини, була першим широко застосовуваним гіполіпідемічним засобом (3). Катехоламіни та натрійуретичні пептиди є основними гормонами, що стимулюють цей катаболічний шлях у людини (4). Стійкість до індукованого катехоламіном ліполізу в підшкірній жировій тканині була продемонстрована у дорослих із ожирінням у дорослих та дітей (5,6), що пояснюється зниженням експресії ліполітичних β2-адренорецепторів (7), підвищенням антиліполітичних властивостей α2-адренорецепторів (8) та зниження експресії гормоночутливої ліпази (HSL) (9). Можливо, дефект HSL є найважливішим фактором, оскільки він також спостерігається у неблагополучних родичів першого ступеня, що страждають ожирінням (10), і оскільки існує позитивний зв’язок між ліполітичною здатністю та експресією HSL у підшкірно-жирових клітинах людини (11).

Роль обмеження швидкості HSL у ліполізі жирової тканини була оскаржена даними мишей-нокаутів HSL (12–15). Індукований катехоламінами ліполіз скасовується, але залишковий базальний ліполіз спостерігається в адипоцитах нульових HSL мишей. Ці дані свідчать про існування ліпаз, що не містять HSL, у жировій тканині. Нещодавно була виявлена нова тригліцеридна ліпаза, яка називається жировою тригліцеридною ліпазою (ATGL), деснутріном або iPLA2ζ (16–18). Використовуючи антитіла, спрямовані проти ATGL, Zimmerman et al. (16) припускають, що ATGL відповідає за 75% активності цитозольної ацилгіролази в білій жировій тканині мишей з дефіцитом HSL. Тому ATGL може брати участь разом з HSL у ліполізі жирової тканини. Карбоксилестераза 3 (або триацилгліцеринова гідролаза) була частково очищена від білої жирової тканини миші і показала, що вона має ліпазну активність (19). Його внесок у ліполіз невідомий. Тут ми вивчили відносний внесок HSL та інших ліпаз у ліполіз жирової тканини та прагнули визначити, чи були при ожирінні зміни ліполізу адипоцитів та експресії HSL.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Ферментативна активність ліпази.

Байєр розробив серію (5- (2H) -ізоксазолоніл) сечовин як потужних інгібіторів HSL (20). Селективність сполуки 59 (4-ізопропіл-3-метил-2- [1- (3- (S) -метил-піперидин-1-іл) -метаноїл] -2Н-ізоксазол-5-он), далі названої BAY, оцінювали за ферментативною активністю очищених ліпазних препаратів з використанням 1 (3) -моноолеоїл-2-0-моноолеїл гліцерину (MOME) для HSL щурів та людини, моноолеїну для ліпози моногліцеридів миші та триолеїну для ліпопротеїнової ліпази бичачого та свинячої панкреатичної ліпази основи (21,22). MOME - це аналог діацилгліцерину. Це дозволяє вимірювати активність діацилгліцерилгідролази і не є субстратом для моноацилгліцерилліпази. Клітини Cos7 трансфікували векторами pcDNA3, pcDNA3-людини HSL та pcDNA3-людини ATGL (17,23). Гідроліз тріолеїну вимірювали на клітинних екстрактах.

Генерація та аналіз нуль-нульових мишей HSL.

Когорти вивчення.

Перша когорта включала 14 чоловіків із ожирінням та 67 жінок із ожирінням у віці 36 ± 8 років з ІМТ 37 ± 5 кг/м 2 та 29 жінок, які не страждали на ожиріння, та 13 чоловіків у віці 36 ± 9 років з ІМТ 24 ± 3 кг/м 2. Вранці після нічного голодування був відібраний зразок венозної крові для аналізу сироваткового лептину, плазмового інсуліну та глюкози в плазмі (7,9,10); і велику біопсію підшкірно-жирової клітковини (3–5 г) було отримано з черевної області шляхом голкової аспірації під місцевою анестезією. Друга когорта включала 80 здорових жінок із ожирінням з ІМТ 31–52 кг/м 2 та віком 21–63 роки. Третя когорта включала суб'єктів європейського багатоцентрового дослідження NUGENOB (Взаємодія генів поживних речовин при ожирінні людини; www.nugenob.org). 24 жінки з ожирінням мали вік 31 ± 7 років з ІМТ 37 ± 5 кг/м 2. Третя когорта досліджуваних виконувала 10-тижневу програму, засновану на дієті з обмеженим енергопостачанням, що забезпечує на 600 ккал менше загальних добових витрат енергії. Після дієтичного втручання ІМТ зменшився до 34 ± 5 кг/м 2 (Р 80 із ожирінням та 40 осіб, які не страждають від ожиріння. Значення - середнє значення ± SD в тексті та значення ± SE на рисунках. Дані порівнювали Вілкоксон, Манн-Уітні або Крускал -Тест Уолліса.

РЕЗУЛЬТАТИ

Вплив інгібітора HSL на ліпази та ліполіз.

Селективність BAY для інгібування HSL. В: Інгібування реакції концентрації за допомогою BAY очищеного HSL людини (hHSL) або HSL щурів (rHSL), ліпази підшлункової залози (PL), ліпопротеїн-ліпази (LPL) та моногліцерид-ліпази (MGL) (n = 3). B: BAY (10-6 моль/л) інгібування активності тригліцеридів гідролази в клітинах Cos7, що експресують HSL людини або ATGL людини (n = 3). C: Інгібування концентрації-відповіді за допомогою BAY активності екстракту тригліцеридів гідролази екстракту жирової тканини миші (n = 3). D: BAY (10-6 моль/л) інгібування активності тригліцеридів гідролази в екстрактах жирової тканини миші дикого типу та HSL-нульового нуля (n = 4).

Ліполіз в ізольованих адипоцитах мишей дикого типу та нульових HSL. В: Вивільнення гліцерину (n = 5). Криві концентрації-відповіді ізопреналіну проводили без BAY (квадрати), з 10 −8 моль/л BAY (алмази) або з 10 −6 моль/l BAY (трикутники). B: Вивільнення гліцерину (n = 3). Інгібування концентрації-відповіді BAY вимірювали при ліполізі, індукованому 10-4 моль/л ізопреналіну. C: Випуск FFA (n = 3). Інгібування концентрації-відповіді BAY вимірювали при ліполізі, індукованому 10-4 моль/л ізопреналіну.

Вплив BAY на ліполіз жирових клітин людини. A: Антиліполітичні ефекти BAY (▪, 10-10 моль/л; □, 10−7 моль/л), інсуліну (•, 10−8 моль/л) та простагландину E2 (▵, 10-5 моль/л) ) на індуковане ізопреналіном вивільнення гліцерину. ○, крива доза-реакція ізопреналіну без антиліполітичних засобів (n = 4). B: Вплив BAY на базальний (□), індукований ізопреналіном (○, 10 −7 моль/л) та індукований передсердним натрійуретичним пептидом (▴, 10 −7 моль/л) вивільнення гліцерину (n = 3). C: Інгібування BAY (10-5 моль/л) базального, індукованого ізопреналіном (Iso, 10-7 моль/л) та індукованого передсердним натрійуретичним пептидом (ANP, 10-7 моль/л) гліцерину та вивільнення FFA (n = 6). D: BAY (10-6 моль/л) інгібування активності тригліцеридів (триолеїну) та дигліцеридів (MOME) в екстрактах жирової тканини людини (n = 4).

Експресія гена HSL та ATGL у жировій тканині людини.

Експресія гена HSL та ATGL у жировій тканині людини. Рівні мРНК HSL та ATGL визначали кількісно за допомогою кількісної ПЛР зворотної транскрипції та нормалізували за рівнями 18S рРНК. В: Рівні мРНК HSL та ATGL в ізольованих адипоцитах та фракції строма-судин (SVF) з жирової тканини людини (n = 6). Б: Експресія мРНК γ (PPARγ), що активується проліфератором, активованим проліфератором HSL, ATGL під час диференціювання преадипоцитів людини (n = 5). C: Зв'язок між рівнями мРНК HSL та ATGL у підшкірній жировій тканині у 80 жінок із ожирінням. D: Зв'язок між варіацією мРНК HSL та ATGL під час гіпокалорійної дієти в підшкірній жировій тканині у 24 жінок із ожирінням. Рівні мРНК HSL та ATGL вимірювали до і після 10-тижневої гіпокалорійної дієти. Варіації розраховуються наступним чином для кожної людини: (рівень мРНК після дієти - рівень мРНК перед дієтою)/рівень мРНК перед дієтою.

Порівняння суб'єктів, які не страждають ожирінням та ожирінням.

Ліполіз, секреція лептину та експресія HSL у зрілих адипоцитах та диференційованих преадипоцитах від ожиріння та худих суб'єктів. В: Вивільнення гліцерину та лептину в ізольованих зрілих адипоцитах від 42 худих та 81 осіб із ожирінням. B: Вивільнення гліцерину та лептину в преадипоцитах диференціюється у первинній культурі від 42 худих та 81 осіб із ожирінням. C: Експресія білка HSL та β2-адренорецептора (β2-AR) у диференційованих людських преадипоцитах від 14 осіб із ожирінням та 7 худих суб’єктів, визначених за допомогою Вестерн-блот-аналізу.

Щоб з’ясувати, чи є дефект ліполізу первинним чи вторинним для ожиріння, ми використовували преадипоцити, приготовані з тих самих біопсій, що і зрілі жирові клітини. Частка преадипоцитів, які диференціювались в адипоцити, була однаковою як у осіб, що не страждають ожирінням, так і у осіб із ожирінням: 60 ± 20% та 57 ± 18% відповідно. Розмір клітин також був подібним у людей із ожирінням та у пацієнтів, які не страждали від захворювання: 1,8 ± 0,4 × 10 −9 м 2 та 1,5 ± 0,3 × 10 −9 м 2 відповідно. Диференційовані преадипоцити виявляли подібну секрецію лептину у пацієнтів із ожирінням та без них, тоді як стимульований норадреналіном та ізопреналіном ліполіз був знижений на 60–70% у пацієнтів із ожирінням (P статистичні методи). Експресія HSL зменшилась на 60% у клітинах із ожирінням (рис. 5С). Не було різниці між групами у експресії білка β2-адренорецептора.

ОБГОВОРЕННЯ

Модель стимулюючих шляхів при ліполізі жирової тканини людини. Для наочності важливі неферментативні модулятори ліполітичного процесу, такі як периліпіни, не показані. AC, аденилилциклаза; AR, адренорецептор; DG, дигліцерид; FA, жирна кислота; ГХ, гуанілатциклаза; Gs, стимулюючий G білок; MG, моногліцерид; MGL, моногліцерид ліпаза; NPRA, натрійуретичний пептидний рецептор А; РКА, протеїнкіназа А; PKG, протеїнкіназа G; ТГ, тригліцериди.

Підводячи підсумок, це дослідження демонструє, що HSL є основною ліпазою, що каталізує обмежувальну швидкість в стимульованому ліполізі у людей, тоді як ATGL бере участь у базальному ліполізі. Зниження ліполізу, спричиненого катехоламінами, але не вироблення лептину в підшкірній жировій тканині пацієнтів із ожирінням, є раннім, можливо, первинним дефектом, який пов’язаний зі зниженням експресії білка HSL.

Подяка

Це дослідження отримало підтримку від Шведської дослідницької ради, Програми Національної програми з питань харчування Хумейне, Шведської асоціації діабетиків, Фонду Novo Nordic, Шведського фонду серця і легенів, Фонду Бергвала, Фонду Торе Нільссона, Короля Густава V та Фонд Королеви Вікторії та програми NUGENOB (Взаємодія генів поживних речовин при ожирінні людини) та HEPADIP (Печінкова та жирова тканини при метаболічному синдромі), підтримані Європейською комісією (контракт № QLK1-CT-2000-00618).

Ми дякуємо доктору Максу Лафонтану (Національний інститут Сантету та університету медичних досліджень U586) за цінні коментарі до рукопису. Ми також дякуємо доктору Кевіну Клермонту та Дереку Лоу (Байєр) за пожертвування BAY та професору Гунілі Олівекроні (Університет Умео) та Шарлотті Ерлансон-Альбертссон (Університет Лунда) за надання очищених препаратів ліпопротеїнової ліпази бичачого та панкреатичної ліпази свиней відповідно. . Вдячна технічна допомога Габі Острем, Катаріни Гертель, Брітт-Марі Лейонхуфвуд, Єви Сьолін, Керстін Велен, Сесіль Ріу, Марі-Аделін Маркес, Біргітти Даніельссон та Ен-Хелен Торен дуже цінується.