Зміст ендометріотичних кіст, особливо висока концентрація вільного заліза, є можливою причиною канцерогенезу в кістах через стійкий окислювальний стрес, викликаний залізом

Анотація

Призначення: Відомо, що ендометріотичні кісти перетворюються на рак яєчників, такий як прозорі клітинні та ендометріоїдні карциноми. Ми висунули гіпотезу, що багате залізом середовище, що утворюється шляхом повторення крововиливу в ендометріотичні кісти протягом репродуктивного періоду, може відігравати вирішальну роль у канцерогенезі в цистах через індукований залізом стійкий окислювальний стрес.

Експериментальний дизайн: Вміст кіст яєчників людини, включаючи 21 ендометріотичну кісту, 4 ясноклітинні карциноми та 11 неендометріотичних кіст, аналізували на вміст вільного «каталітичного» заліза, лактозидегідрогенази, потенційного антиоксиданту, пероксиду ліпідів та 8-гідрокси-2′- дезоксигуанозин (8-OHdG). Осадження заліза та рівні 8-OHdG також аналізували гістологічно. Форми активного кисню та мутагенність вмісту в ендометріотичній кісті визначали in vitro.

Результати: Концентрація вільного заліза в ендометріотичних кістах (100,9 ммоль/л) була значно вищою, ніж у неендометріотичних кістах (0,075 ммоль/л; Р 10 років) ендометріозу яєчників (6). Патологічно атиповий ендометріоз, який характеризується ендометріотичними залозами з цитологічною та/або архітектурною атипією (7), був зареєстрований у 22,6% (7 з 31) ендометріоїдних та 36,0% (18 з 50) прозороклітинних аденокарцином яєчника, тоді як лише у 1,7% (4 з 255) випадків ординального ендометріозу яєчників (8). Рак яєчників, що виник у ендометріотичній кісті, демонструє переважну частоту прозорих клітинних та ендометріоїдних типів (> 40%), тоді як серозна та муцинозна аденокарцинома переважає у раку яєчників, не пов'язаного з ендометріозом (8), що свідчить про різний механізм канцерогенезу між раком у ендометріотична кіста яєчника та рак яєчників загалом.

Бімолекулярні особливості раку яєчників, що виникли в ендометріотичній кісті, також були широко вивчені, такі як мутація генів K-RAS та PTEN (9), зміна BCL-2 та P53 (10), зниження експресії hMLH та PTEN (11 ) та підвищений фактор росту судинного ендотелію (12). Також повідомляється про втрату гетерозиготності в області онкосупресора при ендометріозі (7, 13) та загальну втрату гетерозиготності при супутньому ендометріозі та карциномі (14). Повідомляється, що генетична мишача модель перитонеального ендометріозу розвивається шляхом індукції онкогенного K-ras та ендометріоїдної аденокарциноми яєчників шляхом подальшої делеції Pten (15). Тому було виявлено кілька молекулярних механізмів, що беруть участь у канцерогенезі ендометріозу. Однак точний механізм, який може пояснити унікальність канцерогенезу в ендометріотичній кісті, ще належить з'ясувати.

Повторне крововилив у кісту протягом менструального циклу та накопичення компонентів крові в кісті характеризуються ендометріотичною кістою. У цьому дослідженні ми зосередили увагу на вмісті ендометріотичних кіст, особливо на високій концентрації вільного заліза як причини канцерогенезу кісти. Під гіпотезою, що рідина ендометріотичних кіст, що містить залізо, сприяє генетичним змінам через окислювальний стрес (16–18) і може бути однією з основних причин злоякісної трансформації ендометріотичних кіст, ми дослідили концентрацію заліза в ендометріотичній кісті та інші кісти. Крім того, ми дослідили продукти окисного стресу у вмісті кіст. Проводили експерименти in vitro, чи може вміст ендометріотичних кіст спричинити пошкодження ДНК чи ні.

Матеріали і методи

Зразки. Зразки були отримані у пацієнтів з кістами яєчників, які отримували хірургічне лікування в Університетській лікарні Кіото за письмовою формою згоди. Вміст кісти яєчника зберігали при -80 ° C відразу після операції або центрифугували при 3000 або 4000 об/хв протягом 10 хв; супернатанти потім зберігали при -80 ° C.

Культура клітин. Встановлені нами безсмертні клітини поверхневого епітелію яєчників підтримувались, як описано раніше (19, 20). Безсмертні клітини залоз ендометрія людини, люб’язно надані доктором С. Кіо (Університет Каназава, Каназава, Японія; посилання 21), та клітинна лінія клітин фібробластів легенів китайського хом'ячка (клітини V79), придбані у RIKEN BioResource Center Cell Bank, культивували в DMEM (Nikken Bio Medical Laboratory), що містить пеніцилін-стрептоміцин (100 одиниць/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину; Nacalai Tesque) і 10% фетальної бичачої сироватки (об/об; BioWest).

Виявлення вільного заліза (іонів заліза) в рідині кісти. Реакційну суміш додавали в одноразові пробірки з безіонних металевих пластиків у наступному порядку: 0,5 мл ДНК тимусу теляти натрієвої солі типу I (1 мг/мл; Sigma-Aldrich), 0,05 мл гідрохлориду блеоміцину (1 мг/мл; ласкаво забезпечується Nippon Kayaku), 0,1 мл MgCl2 (50 ммоль/л; Nacalai Tesque), 0,1 мл проби, 0,05 мл HCl (10 ммоль/л; Nacalai Tesque), 0,1 мл надчистої води та 0,1 мл 0,14% аскорбіну розчин кислоти (в/в; Nacalai Tesque). Стандартну криву готували з використанням Fe (NO3) 3, розчиненого в надчистій воді. Зразки рідин ендометріотичних кіст розчиняли в ультрачистій воді від 1 до 40000 разів, щоб отримати концентрацію вільного заліза від 0 до 250 мкмоль/л. Вміст пробірки перемішували до і після додавання аскорбату, а потім інкубували при 37 ° С протягом 2 годин при струшуванні. Потім для зупинки реакції додавали 1 мл 0,1 моль/л ЕДТА (Додзіндо) і вміст пробірки змішували з 1 мл 1% тіобарбітурової кислоти (мас./Об.; Мерк) у 50 ммоль/л NaOH (Nacalai Tesque ) і 1 мл 25% HCl (об/об; Nacalai Tesque). Розчини нагрівали при 100 ° С протягом 15 хв і охолоджували, і хромоген вимірювали за поглинанням при 532 нм.

Виявлення лактозодегідрогенази в рідині кісти. Збережені зразки для хімічного аналізу розморожували та центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв та аналізували методом, рекомендованим Японським товариством клінічної хімії, використовуючи лактозу дегідрогеназу CicaLiquid J (Kanto Chemical Co., Inc.). Якщо результат був> 1000 МО/л, зразок розводили в 10 разів 0,9% розчином NaCl.

Виявлення потенційного антиоксиданту в рідині кісти. Потенційний антиоксидант (PAO) вимірювали за допомогою набору для аналізу PAO (Японський інститут контролю старіння, Nikken SEIL Corp.), який вимірює антиоксидантну здатність, використовуючи зменшення іону міді (Cu 2+ до Cu +), згідно з даними виробника протокол. Збережені зразки розморожували і центрифугували при 10000 × g при 4 ° C протягом 60 хв. Супернатанти, ультрафільтровані з молекулярною масою 10 000, аналізували за допомогою набору.

Виявлення перекису ліпідів у рідині кісти. Збережені зразки для хімічного аналізу розморожували та центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв, а рівні пероксиду ліпідів (LPO) визначали методом гемоглобін-метиленового синього з використанням детермінатора LPO (Kyowa Medix Co. Ltd.).

Виявлення 8-гідрокси-2-дезоксигуанозину в рідині кісти. 8-гідрокси-2′-дезоксигуанозин (8-OhdG) є одним з основних окисно модифікованих продуктів основи ДНК in vivo і схильний до мутацій (G: C до T: A трансверсія; посилання 22). Збережені зразки розморожували і центрифугували при 10000 × g при 4 ° C протягом 60 хв. Супернатанти, ультрафільтровані з молекулярною масою 10000, були проаналізовані за допомогою набору високочутливих 8-OHdG Check ELISA (Японський інститут контролю старіння, Nikken SEIL Corp.).

Прусське синє фарбування зразків тканин людини для виявлення заліза. Тканини фіксували у 10% забуференному формаліні та вкладали у парафін. Зрізи депарафінізували і занурювали на 20 хв у робочий розчин, що складається з рівних кількостей 5% ферроціаніду калію [K4Fe (CN) 6] та 5% розчину соляної кислоти (Nacalai Tesque). Контраст здійснювали за допомогою Nuclear Fast Red (Lab Vision Corp.) протягом 5 хв.

Оцінка відкладень заліза у зразках тканин людини. Осадження заліза класифікували після фарбування прусського синього кольору за методом Blanc et al. (23), з деякими модифікаціями, такими: марка 0, відсутність заліза; ступінь 1, м’яке осадження залізом ледь підтверджене при збільшенні × 400; клас 2, помірне осадження із залізом, видимим при збільшенні × 40; і ступінь 3 - сильне осадження заліза, видно на предметних стеклах неозброєним оком.

Імуногістохімічний аналіз 8-OHdG у зразках тканин людини. Тканини, закріплені у 10% забуференному формаліні та вкладені у парафін, депарафінізували та гідратували, а імуногістохімічне фарбування 8-OHdG проводили, як описано раніше (24), використовуючи моноклональне анти-8-OHdG антитіло (N45.1) як основне антитіло, біотин -мічене кроляче антитіло проти мишачого IgG як вторинне антитіло та кон'югований з пероксидазою стрептавідин (Vector Laboratories).

Оцінка 8-OHdG у зразках тканин людини. Освіта 8-OHdG оцінювали імуногістохімічним методом і визначали таким чином: ++, очевидно, сильніший за нормальну строму яєчників; +, трохи або частково (6 на лунку. Через 24 години інкубації середовище обмінювали на середовище, що містить досліджувані матеріали, і культури додатково інкубували протягом 24 годин. Потім клітини промивали PBS і збирали, висівали на 100 -мм культурна посуд при 1 × 10 6 на блюдо, і культивована протягом 6 днів, зібрана, замінена в середовищі, що містить 6-TG (10 мкг/мл; Sigma-Aldrich), при 3 × 10 6 на 100-міліметровій посуді, і культивували ще 12 днів. Кожну обробку проводили в трьох примірниках з використанням трьох зразків у кожному експерименті. Колонії фарбували розчином Гімзи (Nacalai Tesque) і підраховували кількість колоній в кожній посуді. Етилметансульфонат (Nacalai Tesque; 500 мкг/мл) використовували як позитивний контроль, а нормальне середовище - як негативний контроль.

A, концентрація вільного заліза в ендометріотичних кістах (n = 21; середнє значення ± SD: 100,9 ± 115,1 ммоль/л), ясноклітинній рак (n = 4; середнє значення ± SD: 4,27 ± 2,42 ммоль/л) та неендометріотичних кістах ( n = 11; середнє значення ± SD: 0,075 ± 0,081 ммоль/л). B, концентрація лактозодегідрогенази як маркера пошкодження тканин при ендометріотичних кістах (n = 20; 7 715 ± 4540 МО/л), ясноклітинній карциномі (n = 4; 5817 ± 4739 МО/л) та неендометріотичних кістах (n = 11; 64,5 ± 102,5 ОД/л). С, концентрація ПАО як антиоксидантного маркера в ендометріотичних кістах (n = 18; 1164 ± 687 ммоль/л), ясноклітинній карциномі (n = 4; 1062 ± 119 ммоль/л) та неендометріотичних кістах (n = 11; 557 ± 264 ммоль/л). D, концентрація ЛПО як окисного маркера в ендометріотичних кістах (n = 18; 75,7 ± 73,4 нмоль/мл), ясноклітинному раку (n = 3; 25,2 ± 17,7 нмоль/мл) та неендометріотичних кістах (n = 10; 2,93 ± 5,48 нмоль/мл). E, концентрація 8-OHdG як окислювального маркера та маркеру пошкодження ДНК при ендометріотичних кістах (n = 19; 0,588 ± 0,612 нг/мл), ясноклітинній карциномі (n = 4; 0,181 ± 0,237 нг/мл) та неендометріотичних кістах ( n = 11; 0,0266 ± 0,0592 нг/мл). F, знайдено значущу позитивну кореляцію між вільним залізом та 8-OHdG (P = 0,0000000046). Δ, середнє; •, кожен результат.

Виявлення факторів, пов’язаних з окислювальним стресом, у вмісті кісти. Рівень лактозидегідрогенази, маркер пошкодження тканин, був значно вищим у ендометріотичних кіст (7715 ± 4540 МО/л), ніж у інших доброякісних кістах яєчників (64,5 ± 102,5 МО/л; Р = 0,000040). Середня концентрація ПАО, антиоксидантного маркера, була значно вищою в ендометріотичних кістах (1164 ± 687 ммоль/л), ніж у серозній або муцинозній цистаденомі (557 ± 264 ммоль/л; Р = 0,0032). Концентрації LPO, окисного маркера та 8-OHdG, маркера окисного ДНК, були значно вищими в ендометріотичних кістах (75,7 ± 73,4 нмоль/мл та 0,588 ± 0,612 нг/мл, відповідно), ніж у інших цистах ( 2,93 ± 5,48 нмоль/мл, Р = 0,00014 та 0,0266 ± 0,0592 нг/мл, Р = 0,000048 відповідно; Рис. 1B-E). Ясноклітинний рак показав проміжні рівні між ендометріотичними кістами та іншими доброякісними кістами щодо всіх речовин. Концентрація 8-OHdG суттєво корелювала з концентрацією вільного заліза (Р = 0,0000000046; рис. 1F).

Відкладення заліза в кістах яєчників та тканинах раку яєчників. Відкладення заліза в ендометріотичних епітеліальних клітинах спостерігали гістологічно за допомогою прусського синього фарбування (табл. 1). В ендометріотичних кістах 3 ступінь оцінювали у 14 випадках (70%), тоді як у інших доброякісних кістах яєчників 0 ступінь оцінювали у всіх випадках, крім одного (92,9%). В ендометріотичних кістах відкладення заліза виявляли в стромі, а іноді і в епітеліальних залозистих клітинах (рис. 2А і В). Існувала статистично значуща різниця у відкладанні заліза між ендометріотичними кістами та неендометріотичними кістами (Р = 0,00013). При раку яєчників без ендометріотичних кіст оцінка 0 була оцінена у восьми випадках (66,7%). При раку яєчників з ендометріотичними кістами оцінка 0 була оцінена у трьох випадках (15%), 1 ступінь у шести випадках (30%), 2 ступінь у дев’яти випадках (45%) та 3 ступінь у двох випадках (10%). Кілька прозорих клітинних ракових захворювань з ендометріозом показали відкладення заліза, особливо в зоні трансформації між ендометріозом та раковими клітинами яєчників (рис. 2С), тоді як лише один злоякісний випадок без ендометріозу містив відкладення заліза 3 ступеня. Атиповий ендометріоз спостерігався в зоні трансформації п’яти випадків ясноклітинного раку. У чотирьох випадках виявлено відкладення заліза 2 ступеня в області строми, але не в епітелії (рис. 2D).

Прусське синє фарбування відкладень заліза при пухлинах яєчників