Змішана добавка α-кетокислоти полегшує хронічне прогресування захворювання нирок шляхом інгібування шляхів NF-kB та MAPK

Анотація

Передумови

Введення кето-аналогів відіграє важливу роль у допоміжній терапії клінічних хронічних захворювань нирок (ХХН), проте попередні дослідження щодо їх ренопротекторного ефекту в основному були зосереджені на патологічних змінах нирок, викликаних нефректомією. Це дослідження було розроблене для вивчення нині недостатньо вивчених альтернативних механізмів, за допомогою яких таблетки α-кетокислоти (КА) впливали на ішемічно-реперфузійну (ІР), спричинену пошкодженням нирок миші, та вивчення поточного стану введення КА щодо запобігання прогресуванню ХХН у хворих на ХХН у Китаї. на різних етапах.

Методи

В експерименті на тваринах проводили ІЧ-операцію для імітації прогресуючої хронічної травми нирок, тоді як КА вводили перорально. Для клінічних досліджень було проведено ретроспективне когортне дослідження, щоб окреслити використання та ефекти КА на ослаблення загострення ХХН. Кінцева точка ХХН визначалась як 50% зниження початкової оціненої швидкості клубочкової фільтрації (eGFR). Для розрахунку кумулятивної ймовірності досягнення кінцевої точки та коефіцієнта ризику погіршення функції нирок були прийняті аналіз Каплана – Мейєра та модель регресії пропорційної ЦОГ.

Результати

У дослідженні на тваринах KA представив захисний ефект на індуковану ІЧ пошкодження нирок та фіброз шляхом послаблення запальної інфільтрації та апоптозу шляхом інгібування ядерних факторів-каппа B (NF-κB) та мітоген-активованих протеїнкіназ (MAPK). У клінічних дослідженнях після коригування основних демографічних факторів у пацієнтів на 4 та 5 стадіях у групі КА спостерігалася значно уповільнена та повільна частота зниження РКФР порівняно з такою у групі No-КА (коефіцієнт ризику (ЧСС) = 0,115, 95% довірчий інтервал (ДІ) 0,021–0,639, стор = 0,0134), демонструючи позитивний ефект КА на зупинку прогресування ХХН.

Висновок

KA покращив індуковану ІЧ хронічну ниркову травму та фіброз і, здавалося, був потенційним захисним фактором у кінцевій стадії ниркової хвороби.

Передумови

Хронічна хвороба нирок (ХХН) стала найважливішим питанням охорони здоров’я через її прогресуючі, незворотні патологічні зміни та ускладнення, включаючи анемію, дисліпідемію та гіперпаратиреоз. Попередні дослідження продемонстрували, що метаболізм білка, який в основному походить від щоденного раціону, бере участь у більшості цих несприятливих патологічних змін [1]. Таким чином, дієтичне втручання з обмеженим споживанням білка було запропоновано як надзвичайно важливу терапевтичну стратегію для затримки прогресуючого зниження функції нирок та розвитку ХХН.

Модель нирково-ішемічно-реперфузійної (ІР) травми надає перевагу спостереження за репарацією нирок після гострої травми нирки, одночасно імітуючи транзиторну ішемію нирки в таких клінічних випадках, як поліорганна недостатність та нирки перед трансплантацією, таким чином пропонуючи уявлення про виживання алотрансплантата після трансплантації нирки [ 15, 16]. Терапія кето-аналогами LPD забезпечує достатнє споживання незамінних амінокислот без відходів білка та надлишкового виробництва та накопичення метаболічного токсину. Подальше розуміння його механізму дії при ХХН було б корисним для розширення сфери застосування.

У цьому дослідженні ми прийняли ІЧ-модель для вивчення молекулярного механізму сполуки таблеток α-кетокислоти (КА) при захворюваннях нирок з кута запалення та апоптозу. Добавки КА гальмували шляхи ядерного фактора-каппа B (NF-κB) та мітоген-активованої протеїнкінази (MAPK), що призводило до полегшення запалення та апоптозу, тим самим забезпечуючи прогресування ХХН. Експеримент на тваринах дав додаткові докази на підтвердження ренозахисних ефектів КА при ХХН, як це бачиться в наших клінічних дослідженнях.

Методи

Тварини

Самці мишей C57BL/6 у віці 2 місяців (вагою 25 г) були придбані у Пекінської лабораторії Huafukang Laboratory Animal Technology Co., Ltd, Пекін, Китай і були акліматизовані протягом 1 тижня. Мишей знеболювали 1% пентобарбіталом натрію (0,01 мл/г, Sigma, США) шляхом внутрішньочеревної ін’єкції. ІЧ-операція: двосторонні нирки мишей були затиснуті через 26 хв (Roboz Surgical Instrument Co, Німеччина). Нирковий кровотік відновлювався через кілька секунд після видалення затискача мишачої артерії. Цілі операції проводили при 36,6 ° C – 37,2 ° C, використовуючи машину для регулювання температури (FHC, США). Тварин поділяли на три групи: Sham, IR + Nacl, IR + KA, n = 4–6/група. Мишам у фіктивній групі зробили ту саму операцію, за винятком затискання ниркових судин. Миші в групі IR + Nacl перенесли ІЧ-операцію і лікували Nacl. Мишей у групі IR + KA оперували за допомогою ІЧ-хірургії та лікували KA (FreseniusKabi, Німеччина). Обидві нирки збирали через 28 днів після ІР-операції. Усі експерименти були схвалені Комітетом з догляду за тваринами та використання лікарні Тунцзи (номер IACUC: S851) та проводились відповідно до керівних принципів NIH.

Підготовка та введення КА та ЛПД

З’єднані α-кетокислотні таблетки конфігували сумішшю 0,375 г α-кетокислоти до 6 мл 0,9% Nacl, до кінцевої концентрації 62,5 мг/мл, і вводили шлунково-сосудисто. Концентрація введення становила 1000 мг на кг ваги миші на день. LPD постачав WQJX BIO-Technology (Ухань, Китай). Дієта складалася з казеїну (6,5%), крохмалю (66,45%), глюкози (10%), соєвої олії (7%), фібрину (5%), мінеральної солі (3,5%), вітаміну (1%), л -цистин (0,3%) та хлорид холіну (0,25%) відповідно до дієти для гризунів Американської дієтологічної асоціації, з калорією 3,5 ккал/г для задоволення енергетичних потреб. У групі IR + KA мишей обробляли KA та LPD. Для порівняння, мишей у групі IR + Nacl обробляли 0,9% Nacl та LPD.

Виявлення BUN, TC і TG

Азот сечовини крові (BUN), загальний холестерин (TC) та тригліцериди (TG) тестували за допомогою наборів (Changchunhuili, Китай) відповідно до інструкцій виробника.

Гістологічне, імуноцитохімічне та імунофлюоресцентне фарбування

Двосторонні нирки мишей фіксували у 4% параформальдегіді та вбудовували у парафін. Вбудовані в парафін нирки були розділені на 3 мкм. Патологічне фарбування для періодичного фарбування кислотою-Шиффом (PAS) та червоного Sirius проводили для оцінки ступеня ураження ниркових канальців та інтерстиціального фіброзу. Для імунофлуоресцентного (IF) фарбування зрізи фарбували первинним антитілом Kim-1 (1: 800; R&D), лектином тетрагонолобуса лотоса (LTL, 1: 100, Vector Lab), альфа-гладком'язовим актином (α-SMA, 1: 100, Abcam), колаген I (1: 100, Abcam), CD45 (1:50, Biolegend), CD3 (1:50, Guge, Wuhan) та Ly6G (1:50, Biolegend) при 4 ° C протягом ночі та флуоресцентний мічені вторинні антитіла. Ядра фарбували 4′-6-діамідино-2-феніліндолом (DAPI). Дані були проаналізовані програмним забезпеченням Image Pro Plus (Media Cybemetics, Роквілл, штат Меріленд, США) сліпо.

Вестерн-блот

Ниркові тканини лізували в буфері для лізису RIPA (Promoter, Ухань, Китай), що містить інгібітор протеази (Promoter, Ухань, Китай). Клітинні білки збирали так само. Загальну концентрацію білка визначали за допомогою набору для аналізу білка BCA (Promoter, Ухань, Китай). Білки відокремлювали електрофорезом додецилсульфат натрію – поліакриламідний гель (SDS-PAGE) і переносили на мембрани полівінілідендифториду (PVDF, Millipore, Billerica, MA, США). Мембрани блокували 5% знежиреного молока в TBS з 0,1% Твін-20 протягом 1 год при 37 ° C, а потім зондували антитілами проти α-SMA (1: 5000, Abcam), PDGFR-β (1: 3000, Abcam ), Фібронектин (1: 1000, Abcam), Bcl-2 (1: 1000, Abclonal), BAX (1: 1000, Abclonal), каспаза 3 (1: 1000, Abclonal), NFATc-1 (1: 1000, Abcam ), загальна кількість і фосфорильована-65, -38 та -ERK (1: 1000, технологія сигналізації клітин, США) та GAPDH (1: 4000, Аббкін) при 4 ° C протягом ночі. Плямки промивали наступного дня та інкубували з кон'югованими HRP вторинними антитілами протягом 1 години при 37 ° C. Інтенсивності сигналу цільової смуги визначали кількісно, використовуючи Image J (NIH, США).

Кількісна ПЛР в режимі реального часу

Загальну РНК екстрагували за допомогою реагенту Trizol відповідно до інструкцій виробника (Invitrogen, США). Одна мікрограмна РНК була зворотно транскрибована в кДНК першого ланцюга за допомогою системи зворотної транскрипції GoScript (Promega, США) в реакційній системі 20 мкл. Параметри циклічності використовувались наступним чином: 40 циклів pf денатурації при 95 ° С протягом 15 с і відпал при 60 ° С протягом 60 с. Триразові експерименти для кожної проби були оброблені. Кількісну ПЛР проводили з використанням основної суміші SYBR (Qiagen, Німеччина) на світлі Roche 480II. Рівні експресії мРНК декількох маркерів, включаючи TGF-β, фібронектин та колаген I, проводили методом порівняльного порогу циклу (Ct) та нормалізували до рівнів експресії GAPDH. Послідовності праймерів були перераховані в таблиці 1.

Основна інформація про клінічних хворих на ХХН, зібрана з лікарні Тунцзи

Загальна кількість амбулаторних та стаціонарних хворих з приводу ХХН була набрана з квітня 2015 року по вересень 2018 року в лікарні Тунцзи, медичному коледжі Тунцзи, Університеті науки і техніки Хуачжун для поперечного та ретроспективного дослідження. Загальна кількість 452 пацієнтів були виключені, (1) гемодіаліз, перитонеальний діаліз або трансплантація нирок на початку зарахованого часу; (2) час спостереження був менше 2 разів; (3) основні дані суттєво відсутні. Серед решти зареєстрованих 442 пацієнтів 119 знаходились на 1 та 2 стадіях, лише 9 пацієнтам призначили КА, що суттєво вплинуло на результат аналізу. Для решти 323 пацієнтів на стадіях 3 - 5 148 пацієнтів, які приймали КА, були розділені на групу КА, інші 175 пацієнтів були розділені на групу No-КА. Клінічне дослідження було схвалено Комітетом з медичної етики лікарні Тунцзи, медичний коледж Тунцзи Університету науки і технологій Хуачжун (TJ-IRB20180501). Ми зареєструвались у китайському реєстрі клінічних випробувань (ChiCTR1800016536).

Статистичний аналіз

Дані виражали як значення підрахунку (%) для категоріальних змінних та середнє значення ± SD для безперервних змінних. Порівняння між двома групами проводили непараметричними Т тест для неперервних змінних, а χ 2 тест для категоріальних змінних. Для розрахунку кумулятивної ймовірності досягнення кінцевої точки та коефіцієнта ризику погіршення функції нирок були прийняті аналіз Каплана – Мейєра та модель пропорційної регресії COX. Статистичний аналіз проводили за допомогою SAS v9.4 (SAS, Inc., 200 Cary, NC, USA), і всі значення P обчислювали як двосторонні. Асоціація вважалася значущою з р-значеннями менше 0,05.

Результати

Добавка KA захищала мишей від інфрачервоного ураження нирок та метаболічних розладів

Добавка КА покращила індукований ІЧ інтерстиціальний фіброз

Добавка КА послаблює індуковану ІЧ запальну інфільтрацію та апоптоз

Добавка КА може послабити індуковане ІЧ-запалення та апоптоз, інгібуючи активацію шляхів NF-κB та MAPK

NF-κB та MAPK - це два класичні сигнальні шляхи, що беруть участь у запаленні та апоптозі [20,21,22,23,24]. У групі IR + Nacl експресія фосфорильованого-p65 зросла, як і його молекули NFATc-1 нижче за течією, показуючи, що IR сприяє активації шляху NF-κB. Під час лікування КА активація фосфорильованого р65 частково була пригнічена, а експресія NFATc-1 зменшена (рис. 5а). Одночасно ми вимірювали молекули, пов'язані з шляхами MAPK, і спостерігали подібне збільшення фосфорильованого ERK та p38 у групі IR + Nacl. У групі IR + KA активація гальмувалась зменшенням на 50% p-p38 та 80% p-ERK порівняно з групою IR + Nacl (рис. 5b). Наші результати свідчать про те, що добавка КА полегшує запалення нирок та апоптоз шляхом інгібованої активації шляхів NF-κB та MAPK.

Основні демографічні характеристики клінічних хворих на ХХН на різних стадіях та різниця у статусі функції нирок між людьми із втручанням та без нього

Діаграма пацієнтів протягом усього дослідження

Вплив КА на ймовірність виживання нирок у хворих на ХХН на різних стадіях

Ми поділили зареєстрованих пацієнтів на 3 - 5 стадіях ХХН на групи KA та No-KA відповідно до їх ліків. Кінцева точка події була визначена як> 50% зниження початкового показника СКФ. В аналізі Каплана – Мейєра сукупна ймовірність досягнення кінцевої точки була нижчою в групі КА, ніж у групі No-КА (стор = 0,0241) серед пацієнтів на 4 та 5 стадіях. Для пацієнтів на 3-5 стадіях КА також виявляв захисний ефект на функцію нирок до 30-місячної позначки; через 30 місяців лікування у пацієнтів групи КА спостерігалося погіршення стану нирок. Тільки враховуючи пацієнтів на 3 стадії, частота кінцевих випадків ХХН у групі КА була нижчою, ніж у групі No-КА. Однак загальна частота подій кінцевої точки (n = 0,035, 7 кінцевих подій серед 201 пацієнта) була нижчою, ніж на 4 та 5 стадіях (n = 0,107, 13 серед 122) (рис. 7). Після коригування основних демографічних факторів (включаючи стать, вік, ускладнення, освіту, професію, тютюнопаління та історію вживання алкоголю), люди в групі КА показали значно уповільнену та повільнішу частоту зниження ШКФ в порівнянні з групою No-КА [скоригована небезпека співвідношення, 0,115; 95% ДІ від 0,021 до 0,639; стор = 0,0134 (табл. 4)] серед пацієнтів на 4 та 5 стадіях, що виявляють позитивний ефект КА на прогресування ХХН.

Вплив КА на ймовірність виживання нирок у хворих на ХХН на різних стадіях. Ймовірність досягнення кінцевої точки була нижчою в групі КА, ніж у групі без КА на стадіях 4 та 5 ХХН, коли була скоригована в тесті журналу рангових оцінок (стор = 0,0241). У пацієнтів від 3 до 5 стадії КА також виявляв захисний ефект на функцію нирок до 30 місяців, а через 30 місяців у пацієнтів групи КА погіршилась ниркова ситуація. Для пацієнтів на 3 стадії частота кінцевих точок (n = 0,035, 7/201) у групі КА була нижчою, ніж у групи, яка не отримувала КА, однак, загальна частота кінцевих точок була швидше меншою, ніж на стадіях 4 та 5 (n = 0,107, 13/12)

Обговорення

Висновки

Ми продемонстрували експериментальні дані, що вказують на те, що КА відігравала захисну роль при пошкодженні нирок та фіброзі, спричиненому ІЧ, через інгібування шляху NF-κB та MAPK для послаблення запалення та апоптозу. Тим часом ми спостерігали терапевтичний ефект КА на зупинку прогресування ХХН у клінічних умовах, головним чином у пацієнтів на кінцевій стадії. Наше дослідження забезпечило теоретичну підтримку лікування КА для полегшення прогресування ішемічного ураження нирок у ХХН.