Вплив харчового насіння льону на скорочувальну функцію судин та атеросклероз при тривалій гіперхолестеринемії у кроликів

Анотація

Завданням цього дослідження було визначити вплив дієтичних добавок з насінням льону на функцію судин та розвиток атеросклеротичного ураження при тривалих гіперхолестеринемічних станах. Ми вибрали модель кролика для тестування чотирьох різних дієтичних умов: звичайна контрольна дієта, дієта з додаванням льону, дієта, що містить підвищений рівень холестерину, і дієта, що містить як холестерин, так і лляне насіння. Ми висунули гіпотезу, що лляне насіння з обмеженим харчуванням обмежить атеросклеротичний розвиток та продемонструє захисний ефект проти порушень судинного скорочення, викликаних холестерином.

вплив

Тварини та дієтичні втручання.

Дев'яносто шість самців білих кролів альбіносів Нової Зеландії (NZW) (ферма кроликів Південної Рози, Сент-Клод, Канада), вагою 2,5–3 кг на момент прибуття, були індивідуально розміщені в металевих клітках в кімнаті з контрольованою температурою, вологістю та 12-годинний світловий цикл. Експерименти були розглянуті та схвалені Комітетом з перегляду управління протоколами Університету Манітоби відповідно до вимог Канадської ради з питань догляду за тваринами (48). Тварин випадковим чином розподіляли на чотири групи по вісім тварин за тривалість годування на основі дієтичного лікування. Тварин годували протягом 6, 8 або 16 тижнів. Чотири дієти включали контрольну дієту (RG) звичайного кролячого чау (CO-OP Complete Rabbit Ration, Федеральні кооперативи, Саскатун, Канада), 10% меленого чану з добавкою льону (FX), 0,5% чаю з добавкою холестерину ( СН), а також дієта, доповнена 0,5% холестерину і 10% меленого насіння льону (МВ). Льняне насіння Promega, що постачається компанією Polar Foods у філії Фішер, Канада, містило 71% ПДК. Всі дієти були сухими змішаними та відлякувались, щоб включити додані компоненти. Кроликів годували 125 г відповідного дієтичного лікування на день. Воду давали довільно.

Забір крові та аналіз.

Зразки крові відбирали на початковому рівні (0 тижнів) і через 6, 8 або 16 тижнів дієтичного втручання з крайової вушної вени перед щоденним годуванням. Рівень холестерину та тригліцеридів у плазмі крові вимірювали ферментативно за допомогою комерційних наборів (Thermo Electron). Загальні жирні кислоти витягували із зразків плазми та дериватизували, як описано раніше (4, 38). Жирні кислоти етерифікували до відповідних метилових ефірів, використовуючи розчин ацетилхлорид-метанол-бензол. Подальший аналіз за допомогою газової хроматографії (GC) з виявленням полум’яної іонізації (FID) дав кількісні кількості метилових ефірів жирних кислот (FAMEs). Вміст жирних кислот у зразках було визначено порівнянням із справжніми стандартами (NuChek Prep, Elysian, MN).

Підготовка тканин.

Після 6, 8 або 16 тижнів дієтичного лікування кроликів знеболювали ізофтороном (5%, у кисні, 2 л/хв) і гепаринували. Аорту та сонну артерію вирізали і негайно помістили в холодний 1,9 мМ розчин кальцію Кребса-Генселейта (115 мМ NaCl, 25 мМ NaHCO3, 1,38 мМ KH2PO4, 2,5 мМ KCl, 2,46 мМ MgSO4, 1,9 мМ CaCl2, 11,2 мМ декстрози, рН 7,4 ). Аорта була ретельно розсічена від дистального кінця дуги аорти до основи діафрагми. Аорту та каротиди очистили від адвентиціальної тканини та підготували до тестування судинної функції, ГХ, секціонування або аналізу обличчя.

Оцінка формування атеросклеротичного ураження.

Атеросклеротичні ураження вздовж дистальної частини аорти та сонної артерії оцінювали на обличчі та шляхом поперечного аналізу. Для аналізу обличчя аорту та сонну артерію очищали від периферичної тканини, розкривали поздовжньо та цифрово фотографували, а просвіти зображень аналізували за допомогою програмного забезпечення Silicon Graphics Imaging. Площа ураження була розрахована як відсоток від загальної площі просвіту, покритої атеросклеротичними ураженнями.

Тканину аорти, фіксовану в 4% буферному параформальдегіді і промиту 30% розчином сахарози, забуференного в 1 × PBS, вбудовували в середовище для заморожування тканин (сполука оптимальної температури різання), заморожували при -20 ° C, розрізали на товщину 10 мкм секцій з використанням кріостата та відлиги, встановлених на позитивних предметних стеклах. Зрізи фарбували олійно-червоним O і протифарбовували гематоксиліном, як описано раніше (44).

Після аналізу атеросклерозу обличчя аорти зберігали при -80 ° C, розморожували та гомогенізували для підготовки до екстракції ліпідів хлороформ-метанол, як було детально описано раніше (4, 21). Вилучені ліпіди кількісно визначали, як описано вище.

Експериментальний протокол для оцінки судинної реакції.

Статистичний аналіз.

Дані виражаються як середні значення ± SE. Статистичне порівняння проводили з використанням одностороннього аналізу ANOVA, після чого проводився тест на найменшу значущу різницю Фішера для множинних параметричних порівнянь. Різниця між засобами вважалася значною, коли P

Рис. 1.Холестерин в плазмі (A) і тригліцериди (B) концентрації у кроликів до (0 тижнів) і після 6, 8 або 16 тижнів дієтичних втручань. РГ, регулярне харчування; FX, 10% дієта з додаванням льону; СН, 0,5% дієта з добавкою холестерину; МВ, 0,5% дієти з добавкою холестерину та 10% насіння льону. Значення - середні значення ± SE; n = 4–8. *P

Рівні загальної жирної кислоти в плазмі крові вимірювали у всіх групах (табл. 1). Вміст TFA був підвищений у плазмі груп, що харчуються холестерином, за всіма кінцевими точками. Помітні відмінності вмісту жирних кислот у плазмі крові такі: пальмітинова кислота (C16: 0), пальмітоїлова кислота (C16: 1), стеаринова кислота (C18: 0), олеїнова кислота (C18: 1), лінолева кислота (C18: 2 н -6), а рівні арахадонової кислоти (C20: 4 n-6) були значно вищими в групах СН і МВ порівняно з групами RG та FX після 6, 8 та 16 тижнів, з нижчим рівнем жирних кислот у група CF порівняна з групою CH протягом 16 тижнів. Рівні ALA (C18: 3 n-3) були підвищені у тварин, які годувались як лляним насінням, так і холестерином після усього періоду годування. Невеликий ріст рівня ALA у плазмі крові тварин, що харчувалися холестерином, спостерігався після 16 тижнів. Ейкозапентаенова кислота з довгими ланцюгами омега-3 жирних кислот (ЕРА; C20: 5 n-3) була виявлена ​​лише в групах, що годували холестерином, після 16 тижнів, причому більший рівень спостерігався у групі CF. Рівні докозагексаєнової кислоти (DHA; C22: 6 n-3) у плазмі були виявлені лише у незначних кількостях. Співвідношення n-6 до n-3 ПНЖК було значно нижчим у групах, яким додавали лляне насіння (аж у 91 раз), порівняно з групами RG та CH, причому різниця зменшувалась із тривалістю випробування на годування.

Таблиця 1. Концентрація жирних кислот у плазмі кроликів, яких годували експериментальним раціоном протягом 6, 8 та 16 тижнів

Значення - середні значення ± SE, у мг/мл плазми. Зразки плазми отримували після 6, 8 або 16 тижнів годування (n = 7–8). RG, регулярне годування; FX, 10% насіння льону; СН, 0,5% холестерину; МВ, 0,5% холестерину плюс 10% насіння льону; t, присутні слідові кількості (* P † P § P ‡ P

Таблиця 2. Концентрація жирних кислот у тканинах аорти у кроликів, яких годували експериментальними дієтами протягом 8 та 16 тижнів

Значення - середні значення ± SE, у мг/г тканини. Жирні кислоти витягували з аорти після 8 або 16 тижнів годування (n = 4–5). RG, регулярне годування; FX, 10% насіння льону; СН, 0,5% холестерину; МВ, 0,5% холестерину плюс 10% насіння льону; t, присутні слідові кількості (* P † P ‡ P

Рис.2.Ступінь атеросклеротичних уражень аорти після 6 (A), 8 (B) і 16 тижнів (C.) дієтичного лікування. Площа ураження вимірювалася як відсоток площі просвіту аорти, покритої атеросклеротичними ураженнями. Значення - середні значення ± SE; n = 3–7. *P

Подібний якісний вплив на утворення нальоту спостерігався при аналізі поперечного перерізу (рис. 3). Бляшки були лише у тварин, що харчуються холестерином, і були більш серйозними у тварин, які не отримували добавки з насіння льону. Однак через 16 тижнів захисний ефект харчового насіння льону на товщину нальоту не спостерігався.

Рис.3.Репрезентативні поперечні зрізи аорти з 4 експериментальних груп, що містять олійно-червоні відкладення ліпідів, забарвлені О Група RG, ​​6 тижнів (a); Група FX, 6 тижнів (b). Репрезентативні фотографії з груп RG та FX у 8 та 16 тижнів не показані, оскільки атеросклеротичні ураження не були помітними у групах RG та FX у будь-який момент часу. СН група: 6 (c), 8 (e) і 16 тижнів (g). CF група: 6 (d), 8 (f) і 16 тижнів (h).

Подібні результати щодо утворення атеросклеротичного нальоту спостерігались у сонних судинах, хоча ступінь атеросклерозу була не такою важкою (рис. 4). Каротиди не збирали після 6-тижневого випробування. Після 8 тижнів дієтичних добавок утворення атеросклеротичного нальоту в каротидах пригнічувалось включенням льону в холестеринову дієту. Цей захисний ефект був втрачений після 16 тижнів дієтичного втручання.

Рис.4.Ступінь каротидних атеросклеротичних уражень після 8 (A) і 16 тижнів (B) дієтичного лікування. Площа ураження вимірювалась як відсоток світлової площі сонних артерій, покритих атеросклеротичними ураженнями. Значення - середні значення ± SE; n = 4–7. *P

Вага тканин 3-мм відділів аорти, які використовувались для оцінки судинної реакції, не суттєво відрізнявся серед чотирьох груп після 6- та 8-тижневих досліджень. Однак вага тканини аорти був значно більшим через великі атеросклеротичні ураження у групах СН та МВ після 16-тижневого дієтичного втручання порівняно з групами RG та FX (СН, 35,4 ± 2,3; CF, 39,0 ± 4,7; RG, 21,5 ± 0,8; і FX, 20,9 ± 1,5 мг).

Вплив харчового насіння льону та холестерину на скорочувальну реакцію судин.

Спочатку досліджували реакцію аортальних кілець тварин, яких годували різними режимами харчування, як функцію скорочувальних агоністів. Ніяких відмінностей у викликаній KCl вазоконстрикції не спостерігалося в жодних групах після 6 та 8 тижнів дієтичного лікування (рис. 5, A і B). Однак аортальні кільця з обох груп, що містять холестерин, виявляли ослаблену скорочувальну реакцію на KCl порівняно з групами RG та FX після 16 тижнів дієтичного лікування (рис. 5C.).

Рис.5.Скоротлива реакція на 47 мМ KCl проксимальних аортальних кілець, виділених через 6 (A), 8 (B) і 16 тижнів (C.) дієтичного лікування. Значення - середні значення ± SE; n = 5–8. *P

Незначна депресія скорочувальної відповіді на NE спостерігалася після 6 тижнів дієтичного втручання, оскільки препарати аорти з обох груп, що доповнювали холестерин, скорочувались значно менше у відповідь на 10 −7 M NE, ніж групи RG та FX (рис. 6A). Після 8 тижнів дієтичного лікування різниці в скороченні, викликаному NE, не спостерігалося (рис. 6B). Однак групи СН і МВ скорочувались значно менше у відповідь на діапазон концентрацій NE (10-6, 10-5 та 10-4 M NE) порівняно з групами RG та FX після 16 тижнів дієтичного лікування (рис. 6C.). Також спостерігався невеликий спад загальної скорочувальної реакції на СВ, який спостерігався як функція віку всіх тварин (рис. 6, A – C).

Рис.6.Скорочувальна реакція на збільшення доз норадреналіну (NE) проксимальних аортальних кілець, виділених після 6 (A), 8 (B) і 16 тижнів (C.) дієтичного лікування. Значення - середні значення ± SE; n = 6–8. *P

Реакції аортальної релаксації також контролювали після попереднього скорочення 10-6 M NE у залежності від дієтичних втручань. Кільця аорти з групи СН демонстрували значно меншу залежність від ендотелію релаксації у відповідь на більш високі дози ACh (10-6 та 10-5 M), ніж група RG після 6 тижнів дієтичних втручань (рис. 7A). Льняне насіння, додане до дієти, ефективно запобігає цим дефектам, спричиненим холестерином. Після 8 тижнів холестеринового годування група СН зменшилася менше у відповідь на 10-6 М ACh, ніж групи RG та FX (рис. 7B). Знову ж цьому завадило включення льону в раціон. Після 16-тижневого дослідження група СН знову продемонструвала значний дефект ендотеліально-залежної релаксації до ACh. Додавання лляного насіння частково запобігало цим дефектам судинної релаксації, викликаних холестерином; однак захисний ефект більше не досягав статистичної значущості при концентраціях 10 −5 M ACh (рис. 7C.).

Рис.7.Ендотелій-залежне розслаблення у відповідь на ацетилхолін (ACh) в аортальних кільцях після попереднього скорочення з 10 −6 M NE у 6 (A), 8 (B) і 16 тижнів (C.) дієтичного лікування. Результати представлені у відсотках напруги після введення АЧ після попередньої контракції з 10 −6 M NE. Значення - середні значення ± SE; n = 6–8. *P

Незалежне від ендотелію вазорелаксацію також досліджували за допомогою SNP. Результати 16-тижневого дієтичного втручання показані на рис. 8. Не було значущих відмінностей у ступені незалежності ендотелію релаксації до SNP серед чотирьох груп після 16 тижневих дієтичних втручань (рис. 8A). Крім того, швидкість релаксації, спричиненої SNP, також не змінювалась вибором дієтичних втручань (рис. 8B).

Рис.8.A: ендотелійнезалежне розслаблення у відповідь на нітропрусид натрію (SNP) в аортальних кільцях після попереднього скорочення 10-6 M NE, після 16 тижнів дієтичного лікування. Результати представлені як відсоток напруги після введення SNP після попереднього контрактування з 10 −6 M NE. B: швидкість розслаблення у відповідь на 10 −6 M SNP (г напруги/с). Результати представляють втрату напруги протягом першої хвилини після введення 10-6 М SNP. Значення - середні значення ± SE; n = 7–8.

Добавки льону в раціон призвели до значного підвищення рівня ALA в плазмі та аортальній тканині (таблиці 1 та 2). Це підвищення відбулося за відсутності або присутності додаткового харчового холестерину. Незважаючи на те, що плазмова концентрація ЕПК з довгими ланцюгами омега-3 жирних кислот була виявлена ​​лише у низьких рівнях під час годування холестерином після 16-тижневого дослідження, ЕРА та DHA були виявлені в аортальній тканині кроликів, які споживають лляне насіння, та холестерину після 8 тижнів годування. Найвищий рівень спостерігався у тварин, які споживали комбінацію холестерину та льону після подальших випробувань на годівлі. Ці результати демонструють, що ALA метаболізується незначною мірою до більш довгих ланцюгів жирних кислот, таких як EPA та DHA у кроликів. Добавки лляного насіння також знижували співвідношення PU-n-6 до n-3 PUFA, головним чином в результаті підвищеного рівня циркулюючих n-3 PUFA. Додавання харчового лляного насіння до атерогенної дієти також пом'якшило індуковане холестерином підвищення рівня тригліцеридів у плазмі крові (рис. 1B). Ці результати узгоджуються з попередньою роботою в нашій лабораторії з використанням цього дієтичного втручання (4).

Окислювальний стрес може бути ще одним важливим механістичним фактором при індукованій холестерином судинно-скорочувальній дисфункції (22, 28, 33, 43) та при атеросклерозі (35, 57, 75). Наприклад, статини можуть покращити ендотелій-залежну судинну релаксацію у пацієнтів з гіперхолестеринемією, зменшуючи окислювальний стрес (33). Отже, можливо, потужна антиоксидантна здатність лляного насіння відповідала за його благотворну дію на атеросклероз та розслаблення судин (50, 54). Вважається, що SDG лігнану, що міститься в лляному насінні, відповідає за цю антиоксидантну дію (34, 51, 54, 55, 58) і, можливо, також сприяв його захисному ефекту від дефектів судинної релаксації, викликаних холестерином.

Підводячи підсумок, наші дані вперше демонструють, що лляне насіння може захистити від відкладення атеросклеротичного нальоту в сонних артеріях та підтвердити його антиатеросклеротичну дію на аорті. Ми також вперше показали, що дієтичне лляне насіння може покращити ендотелійзалежне розслаблення судин за наявності дієти з високим вмістом холестерину. Однак дієтичне насіння льону не є панацеєю. Якщо дієта з високим вмістом холестерину продовжується, лляне насіння з часом втрачає здатність захищати від уражень, викликаних холестерином. Незважаючи на це обмеження, наші дані підкріплюють гіпотезу про те, що довгострокове прикорм раціону меленим лляним насінням може бути ефективною та безпечною дієтичною стратегією для обмеження ранніх та помірних стадій атерогенезу та судинної дисфункції, пов'язаної з атеросклерозом. Дозування лляного насіння, яке використовувалось у цьому дослідженні, подібне до дози, яка використовувалась раніше в дослідженнях на людях (14, 42). Отже, наші результати свідчать про те, що модифікація дієти з використанням лляного насіння може мати важливу захисну дію на людей проти судинних захворювань як серця, так і при інсульті.

Це дослідження було підтримане грантом Канадських інститутів досліджень охорони здоров’я (CIHR), Ради льону Канади та Директорату природних медичних продуктів. C. M. C. Dupasquier має стипендію доктора наук Канади з питань природничих та технічних досліджень. Б. П. Андер отримав нагороду докторських досліджень Фонду "Серце та інсульт" Канади. Дж. Т. Вігл отримав премію CIHR "Новий слідчий".

СНОПКИ

Витрати на публікацію цієї статті були частково сплачені за рахунок оплати сторінок. Тому стаття має бути позначена цим «реклама”Відповідно до 18 U.S.C. Розділ 1734 виключно для зазначення цього факту.

Ми вдячні Polar Foods та доктору Едварду Кенещуку за надання льняного насіння, збагаченого ALA, для цього дослідження. Ми також дякуємо Андреа Л. Едель, Дж. Алехандро Австрія та Рії Гангулі за цінну технічну допомогу в добуванні та аналізі ліпідів.