Внутрішньошлуночкова ін’єкція LKB1 пригнічує формування ожиріння, спричиненого дієтою, у щурів, активуючи вісь симпатичної нервової системи AMPK-POMC

Кафедра анатомії та гістології людини,

Тяньцзінський медичний університет Тяньцзінь 300070, (Китай)

Тел. 13512093065, електронна пошта [email protected]

Статті, пов’язані з "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Електронна пошта

Анотація

Вступ

Глобальна проблема ожиріння пов'язана з підвищеним ризиком метаболічних захворювань, таких як діабет 2 типу, інсульт, серцеві захворювання, гіпертонія та рак [1-3]. Ожиріння, ймовірно, спричинене енергетичним дисбалансом, що характеризується великим споживанням енергії відносно низьких витрат енергії [4, 5]. Термогенез у жировій тканині є важливим фактором загальних витрат енергії; тому посилення термогенезу в жировій тканині є перспективною терапевтичною стратегією для поліпшення стану ожиріння [6-9].

Дугоподібне ядро (ARC) гіпоталамуса приймає та інтегрує різні входи від периферійних органів і згодом контролює споживання їжі та витрати енергії [22]. Нейрони ARC поділяються на дві різні групи, які діють разом, щоб регулювати поведінку годування: ті, що експресують орексигенні нейропептиди NPY/AgRP (нейропептид Y/пов'язаний з агуті пептидом), і ті, що експресують анорексигенні пептиди POMC/CART (про-опіомеланокортин та кокаїн та амфетамін -пов'язана стенограма) [23]. Різні енергетичні датчики були залучені в клітинний механізм ARC, який регулює метаболізм у всьому тілі. Зниження регуляції AMPKα в ARC сприяє втраті ваги тіла та зменшенню споживання їжі. Таким чином, AMPK необхідний для зондування глюкози як в нейронах AgRP, так і в POMC, а отже і для контролю енергетичного балансу [24]. Нейрони POMC з дефіцитом LKB1 демонструють порушення метаболізму печінкової глюкози з основним зменшенням вивільнення α-меланоцитостимулюючого гормону (α-MSH) з гіпоталамуса [18].

Доведення аденоасоційованого вірусу (AAV) було продемонстровано безпечним і призвело до високої та довготривалої експресії у доклінічних та клінічних дослідженнях [25]. Раніше ми несподівано виявили, що щури з ожирінням, спричиненим дієтою (DIO), мають низький рівень LKB1 у гіпоталамусі [26]. У цьому дослідженні, щоб точно проаналізувати ефект ожиріння LKB1 у щурів DIO, ми вводили LKB1 через доставку AAV у третій шлуночок. Ми виявили, що регуляція LKB1 в гіпоталамусі активувала вісь нейронів симпатичної нервової системи (SNS) нейронів AMPK-POMC, яка може вивільняти адреналін для сприяння побурінню білого жиру. І навпаки, підвищена експресія MC3R/MC4R гальмувала споживання їжі. Ці результати дозволяють припустити, що LKB1 у гіпоталамусі відіграє ключову роль у центральній регуляції ожиріння та забезпечує новий підхід для дослідження централізовано регульованого енергетичного балансу.

Матеріали і методи

Тварини

Самці щурів Спраг-Доулі (140-160 г) були придбані в Пекінській академії військових наук (Пекін, Китай). Тварин утримували в контрольованому середовищі з постійною температурою та підтримували у стандартному циклі 12: 12 год світло/темно (світло світиться о 07: 00, світло вимикається о 19: 00). Для акліматизації в новому середовищі всіх щурів годували стандартною лабораторною чау і доступною водою ad libitum протягом першого тижня. Після адаптації щурам робили внутрішньошлуночкові (ICV) ін’єкції AAV. Після хірургічного втручання щурів розподілили випадковим чином на чотири групи: (1) група жирної їжі з контрольним AAV-EGFP (CF-AAV; 2,0 × 10 8 векторних геномів), яку годували стандартною лабораторною чау (3,8 ккал/г); (2) група з високим вмістом жиру з Control-AAV-EGFP (HF-AAV; 2,0 × 10 8 векторних геномів); (3) група з високим вмістом жиру з низьким титром LKB1-AAV-EGFP (HF-LKB1-L; 2,0 × 10 8 векторних геномів); та (4) група з високим вмістом жиру з високим титром LKB1-AAV-EGFP (HF-LKB1-H; 2,0 × 10 10 векторних геномів), що харчується дієтою з високим вмістом жиру (HFD; 4,76 ккал/г). Масу тіла реєстрували щотижня. Споживання їжі вимірювали щодня. Після годування протягом 9 тижнів жирову тканину, печінку та гіпоталамус збирали наприкінці дослідження.

Усі процедури по догляду за тваринами проводились відповідно до Керівних принципів Комітету з догляду за тваринами Медичного університету Тяньцзіня.

AAV векторний дизайн та підготовка

Клонування та мутагенез проводили за стандартними методиками. Для підготовки вектора використовували два типи трансгену: Control-AAV-EGFP (ген EGFP, керований промотором CMV) та LKB1-AAV-EGFP (ген LKB1, керований промотором CMV). Вектори AAV генерувались шляхом трансфекції клітин AAV-293, як описано раніше [27]. Фізичні титри (у векторних геномах на мікролітр) визначали кількісною ПЛР на 2720 Therm Cycler (Applied Biosystems, Camarillo, USA) з використанням In-Fusion TM PCR Cloning Kit (Clontech, USA) та наступним набором праймерів: вперед, 5′-TGG AGG TAG TGG AAT GGA TCC CGC CAC CAT GGA CGT GGC TGA CCC CCA GC-3 ′ і реверс, 5′-CTC ACC ATG GTG GCG GGA TCCTGC TGC TTG CAG GCC GAG AGC-3 ′.

Ін’єкції ICV

Для введення надмірної експресії LKB1 щурів знеболювали шляхом внутрішньочеревної ін’єкції пентобарбітурату та розміщували на стереотаксичній рамі (KOPF, Німеччина). Шкіру над черепом надрізали, а в черепі над ціллю зробили невеликий отвір за допомогою мікробура. Стереотаксичні координати складали 0,8 мм позаду брегми та 6,5 мм вентральної поверхні черепа [28]. Загальний об'єм 4 мкл вводили за допомогою 10-мкл шприца (Hamilton Co., Reno, NV). Опосередкований AAV ген LKB1 вводили при різних титрах (низький: 2,0 × 10 8 векторних геномів; високий: 2,0 × 10 10 векторних геномів) і при швидкості потоку 1 мкл/хв, після чого голку залишали на місці протягом 2 хв для запобігання зворотному потоку перед відведенням.

Двоенергетичний аналіз рентгенівської абсорбціометрії

В кінці експериментів вимірювання проводились із використанням периферійної подвійної енергії рентгенівської абсорбціометрії (pDXA), як було описано раніше [29].

Аналіз ліпідів крові

Концентрації тригліцеридів печінки (TG), загального холестерину в сироватці крові (TC), холестерину ліпопротеїдів високої щільності (HDL-C) та холестерину ліпопротеїдів низької щільності (LDL-C) вимірювали за допомогою набору хімічних реагентів (Нанкінський інженерний інститут біології, Нанкін, Китай).

Вимірювання рівня адреналіну

Рівні адреналіну в сироватці крові вимірювали за допомогою набору імуноферментних аналізів (NOVUS, Онтаріо, Канада) відповідно до рекомендацій виробника.

Гістологічні дослідження

В кінці лікування WAT і печінку кожного щура видаляли і зберігали для гістологічних досліджень. Зразки жирової тканини зберігали у 4% параформальдегіді протягом 48 год, вкладали у парафін, розрізали на товщину 6 мкм, а потім фарбували гематоксиліном та еозином за допомогою стандартних процедур. Для фарбування Oil Red O тканини печінки заморожували в рідкому азоті та розрізали на ділянки 8 мкм. Зрізи фарбували та аналізували зі збільшенням 200 × за допомогою мікроскопа. Крім того, ДНК жирової тканини епідидиму екстрагували за допомогою набору ДНК (Інженерний біологічний інститут Тяньцзінь Байбей, Тяньцзінь, Китай). Заморожені зрізи гіпоталамуса аналізували за допомогою імуногістохімічного (IHC) фарбування на NPY та POMC (розведення 1: 1000; Abcam, Кембридж, Англія).

Загальна екстракція РНК та ПЛР у реальному часі

Загальну РНК виділяли з жирової тканини реагентом TRIzol (Invitrogen, Camarillo, США). Концентрацію загальної РНК вимірювали спектрофотометром, і кДНК синтезували з РНК (1 мкг) за допомогою набору для синтезу кДНК (Thermo, Camarillo, США) відповідно до інструкцій виробника. Щойно синтезовану кДНК ампліфікували за допомогою специфічних праймерів та реакцій SYBR Green за допомогою SYBR Green qPCR Supermix (Invitrogen). β-актин використовували як внутрішній контроль. ПЛР для кожного гена проводили протягом 40 циклів при 95 ° С протягом 15 с та 60 ° С протягом 1 хв. Для оцінки статистичної значущості використовували t-критерій Стьюдента. Послідовності наборів грунтовок, використаних у цьому дослідженні, наведені в таблиці 1.

Таблиця 1.

Первинна послідовність, що використовується для кількісної ПЛР в режимі реального часу

Вестерн-блот

Загальний клітинний білок із зразків жирової тканини та гіпоталамусу збирали та лізували у буфері RIPA, змішаному з повним коктейлем інгібітора протеази. Концентрацію білка визначали за допомогою набору для аналізу білка BCA. Потім 30-100 мкг кожного зразка денатурованого білка відокремлювали на 10-12% гелі для електрофорезу додецилсульфату натрію в поліакриламідному гелі і переносили на мембрану з фтористим полівінілідену. Мембрану блокували протягом 2 год при кімнатній температурі в 5% розчині, що блокує нежирне молоко, з подальшою інкубацією протягом ночі при 4 ° С окремо з анти-LKB1, анти-MC3R, анти-MC4R (Abcam); анти-AMPKα, антифосфорильовані (p) -AMPKα та анти-UCP1 (Cell Signaling, штат Массачусетс, США) антитіла; В якості контролю завантаження використовували GAPDH. Після інкубації протягом ночі мембрану інкубували з кон’югованим HRP вторинним антитілом (1: 8000; Promega, штат Медісон, США) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Отримані імунні комплекси були виявлені за допомогою вдосконаленого інструменту хемілюмінесценції (CLiNX Science Instruments, Шанхай, Китай). Білкові смуги візуалізували за допомогою авторадиографії, а інтенсивність аналізували за допомогою ImageJ.

Статистичний аналіз

Результати виражаються як середнє значення ± стандартна похибка середнього значення (SEM). Весь статистичний аналіз проводили за допомогою SPSS. Дані аналізували на статистичну значущість за допомогою t-критерію Стьюдента та одностороннього дисперсійного аналізу та post hoc тесту Бонферроні. Значимість була встановлена на рівні 0,05). Ці результати дозволяють припустити, що щури, оброблені LKB1, набрали худу масу і менше жиру.

Надмірна експресія LKB1 змінила гістопатологію щурів, що харчуються HFD

Ми оцінили можливі фенотипічні зміни ВАТ щодо модуляції експресії гіпоталамусу LKB1. Гістопатологія WAT показала, що щури групи HF-AAV мали більші адипоцити, ніж інші групи, тоді як загальний вміст ДНК був найменшим з усіх груп (рис. 3A-B). Крім того, введення LKB1 призвело до зменшення крапель ліпідів у межах WAT, що означає високу метаболічну активність. Що стосується контролів, вміст ДНК був порівнянним у всіх групах (рис. 3В). Масляно-червоне фарбування O припускало, що у щурів HF-AAV були більші краплі ліпідів і жирова печінка. Однак лікування LKB1 призвело до помітного поліпшення крапель ліпідів та стеатозу печінки (рис. 3С). Крім того, ми вимірювали вміст ліпідів у печінці. Порівняно з групою CF-AAV, рівень ТГ у печінці значно підвищувався у щурів групи HF-AAV (p = 0,000). Рівні TG значно зменшувались у групах HF-LKB1-H та HF-LKB1-L відповідно на 26,7% та 21,6%, порівняно з групою HF-AAV (рис. 3D). Як показано на рис. 3E-F, оброблені LKB1 щури мали значно більшу масу BAT, ніж групи CF-AAV та HF-AAV. Ці результати показали, що лікування LKB1 послаблює HFD-індуковану гіпертрофію адипоцитів у ВАТ, попереджує стеатоз печінки та сприяє утворенню BAT.

Рис.3.

LKB1 змінив гістопатологію щурів. (А) Вкладені в парафін зрізи ВАТ фарбували гематоксиліном та еозином. (B) Вимірювали вміст ДНК в епідидимальній ВАТ (збільшення: × 200; шкала шкали: 100 мкм). (C) Заморожені зрізи печінки фарбували маслом червоним О. (D) Рівні TG печінки вимірювали у всіх групах. (E) НДТ в міжлопатковій області. (F) Вимірювали вагу міжлопаткової BAT. Дані є середнім значенням ± SEM. * p # p ### p ### p # p ### p ╄╄╄ p ** p *** p # p ### p ╄╄╄ p