Панкреапедія

Закладка/Пошук у цій публікації

Джонатан Х. Холл (1) і Ден Л. Клеменс (1,2)

Тип методів:

Вступна версія:

Цитування:

Розмір вкладення
Використання вірусу Coxsacklevirus B3 як моделі гострого панкреатиту.pdf 497,11 КБ

1. Вступ

Гострий панкреатит - серйозне гастроентерологічне захворювання, що характеризується запаленням та ураженням екзокринної підшлункової залози. Як правило, це самообмеження, але приблизно в 20% випадків розвиваються важкі клінічні ускладнення, що призводять до тяжкого гострого панкреатиту із наслідком смертності до 30% (25, 39, 40). Важкий гострий панкреатит пов’язаний із системним запаленням, поліорганною недостатністю та високою смертністю. На жаль, в даний час не існує специфічної фармакотерапії для лікування або запобігання прогресуванню цього захворювання.

Найбільш поширеними етіологічними факторами, пов'язаними з гострим панкреатитом у дорослих, є камені в жовчному міхурі та зловживання алкоголем, хоча в 20-30% випадків причина невідома (6). На відміну від загальних етіологічних факторів у дітей є наркотики, інфекції, травми та анатомічні відхилення (32). Цікаво, що в огляді літератури Беніфла та Вейцман повідомили, що приблизно 10% педіатричних випадків гострого панкреатиту були наслідком вірусних інфекцій (3).

2. Матеріали та реактиви

2.1 Матеріали

  1. Агароза
  2. Порошковий модифікований орел Дульбекко
  3. Фетальна бичача сироватка
  4. Ротор і трубки Bechman SW 28 або SW 41
  5. Формальдегід
  6. Кришталева фіалка
  7. Скляні гомогенізатори (шліфувальні машини Dounce Tissue Grinders)
  8. 12 планшетів для культури тканин із лунками

2.2 Реактиви

a. Приготування 0,5% агарози/DMEM

0,5% розчин агарози/DMEM виготовляють шляхом приготування 2 окремих розчинів: 1% розчину агарози та 2X DMEM. 1% розчин агарози готують додаванням 1 г агарози/100 мл дистильованої води і стерилізують автоклавуванням. Потім розчин агарози охолоджують на водяній бані до 55 o C. Два рази розчину DMEM готують шляхом додавання подвійної рекомендованої ваги порошкоподібного DMEM та бікарбонату натрію до об’єму, який ви хочете підготувати (зазвичай 100 мл). РН доводять до 7,2, фільтрують через 0,22 мкм фільтр і нагрівають до 55 o C. 0,5% розчин агарози/DMEM готують, поєднуючи рівні обсяги розчинів агарози та 2X DMEM безпосередньо перед використанням для накладання. клітини.

b. Приготування 20% формаліну

Формалін - це основний розчин 37% формальдегіду. Для приготування 20% формаліну вихідний розчин формаліну розводять 1: 5 дистильованою водою, отримуючи 7,4% формальдегіду

c. Приготування 1% кришталево-фіолетового

Кришталеву фіалку готують додаванням 5 г кристалічно-фіолетової до 395 мл H2O і 105 мл 20% етанолу. Потім розчин фільтрують через 0,22 мкм фільтр.

3. Методи

Віруси CVB3 є патогенами людини (26, 34). Через це при роботі з CVB3 слід застосовувати запобіжні заходи щодо BSL2. Вся робота з цими вірусами повинна виконуватися в затвердженому кабінеті біобезпеки типу II, а будь-яке потенційно забруднене обладнання або тверді відходи повинні бути знезаражені 10% розчином відбілювача або автоклавуванням. Після роботи з тканинами або розчинами, які можуть бути забруднені CVB3, всі поверхні необхідно очистити 10% розчином відбілювача.

Штами CVB3, які ми використовуємо, є патогенами людини, які були виділені від осіб, які перенесли інфекції CVB3. Ці віруси не пристосовані до мишей, але викликають у мишей захворювання, подібні до тих, що спостерігаються у людей (34). Через це ми культивуємо вірус у клітинних лініях людського походження, як правило, клітинах HeLa.

a. Зростання та ізоляція вірусів

b. Титрування вірусу методом аналізу нальоту

Ми використовуємо клітини HeLa для росту та титрування CVB3.

Розрахунки: (15 бляшок)/(3 лунки) * 4 = 20 ПФУ.

Оскільки бляшки підраховували при розведенні 10 -7, титр вірусу становить 20 X 10 7 або 2,0 X 10 8 PFU/мл.

гострого

Малюнок 1. Аналіз нальоту. Представницька табличка для аналізу бляшок. У лунки висівали клітини HeLa при щільності 2 X 10 5/лунку та інкубували протягом ночі. Наступного дня клітини інфікували і покривали 0,5% агарозою/DMEM, як описано в тексті. Пластини інкубували протягом двох днів, клітини фіксували, агарозні накладки видаляли і лист клітин фарбували кришталево-фіолетовим кольором. При розведенні 10 -7 було виявлено 15 бляшок, тому титр вірусної проби становив 2 X 10 8/мл.

c. Вірусна інфекція та генерація панкреатиту

Гістологічний аналіз тканин підшлункової залози у мишей, інфікованих CVB3, демонструє значне запалення екзокринної підшлункової залози та некроз ацинарних клітин відповідно до класифікації середнього гострого панкреатиту у людей, високої захворюваності без смертності. Запальний інфільтрат характеризується насамперед моноцитами (Т-клітинами, В-клітинами та природними клітинами-кілерами) (27, 28). Хоча було показано, що деякі штами вірусу коксакі завдають шкоди острівцям, переважна більшість штамів CVB завдає значної шкоди ацинарним клітинам, але щадить острівці та протоки (19, 45, 46), (37). Хоча існують суперечки щодо механізму, за допомогою якого CVB спричиняє пошкодження тканин підшлункової залози, виявляється, що пошкодження підшлункової залози мишей, інфікованих коксаківірусом, є результатом цитолізу, викликаного вірусом, аутотравлення ферментами підшлункової залози та запальних клітинних опосередкованих пошкоджень тканин (10, 19, 27, 28).

4. Обговорення

Ми встановили фізіологічно значущу доклінічну модель гострого панкреатиту. Ця модель використовує віруси коксакі, виділені від людей, які перенесли інфекцію CVB3. Важливо, що ці віруси не гуманізовані і рекапітулюють багато гістологічних змін, що спостерігаються при гострому панкреатиті людини (34).

Рисунок 2. Гістологія підшлункової залози після зараження CVB3/CO мишей C57BK/6. Мишей заражали 5 X 10 5 PFU/мл CVB3/CO. Тварин евтаназували у зазначений час після зараження та збирали панкреату. Підшлункову залозу фіксували, а зрізи фарбували гематоксиліном та еозином. A) неінфікована тварина, B) через 2 дні після виявлення інфекційного запалення, C) через 4 дні після набряку інфекції, запалення та некроз ацинарних клітин, D) через 8 днів після зараження ознаки відновлення очевидні при збільшенні присутності ацинарних клітин і acini, E) через 12 днів після зараження більшість гострих пошкоджень вирішуються, і багато часток підшлункової залози здаються нормальними; F) через 14 днів після зараження очевидно накопичення внутрішньопанкреатичного жиру.

Накопичення жиру в підшлунковій залозі мишей C57BL/6, інфікованих CVB3/CO, може бути корисною моделлю для неалкогольної хвороби жирової підшлункової залози (NAFPD). Останнім часом НАФПД характеризується і асоціюється зі зниженою функцією підшлункової залози та підвищеним ризиком розвитку цукрового діабету (22, 43). Велике поперечне дослідження показало, що жирова підшлункова залоза була присутня у 35% пацієнтів, які прийшли на медичний огляд, продемонструвавши її поширеність (18).

Важливо, що зараження CVB3 зазвичай щадить острівці підшлункової залози. Таким чином, використання цієї моделі дозволяє вивчати як екзокринні, так і ендокринні розлади підшлункової залози за наявності підвищеного внутрішньошлункового жиру.

Було показано, що віруси Коксакі встановлюють стійку інфекцію зі зменшеною цитопатологією в серцях експериментально інфікованих мишей та природних людей, а також у підшлунковій залозі інфікованих мишей (5, 15, 35). Таким чином, цілком ймовірно, що CVB3 також може зберігатися в підшлунковій залозі людини. Постійна інфекція підшлункової залози CVB3 може відігравати роль у ряді захворювань підшлункової залози. Наприклад, повідомлялося про підвищений титр антитіл до вірусу коксакі у пацієнтів з хронічним панкреатитом (23). І навпаки, можливо, що стійка інфекція CVB3 підтримує запальний відповідь низького рівня або що тривала експресія білків вірусу коксакі змінює важливі клітинні функції. Тому не виключено, що стійка інфекція CVB3 може бути залучена до інших захворювань підшлункової залози, таких як аутоімунний панкреатит та рак підшлункової залози (5). Крім того, накопичення жиру в підшлунковій залозі мишей C57BL/6, інфікованих CVB3/CO, довгий час після закінчення гострої інфекції підшлункової залози, можливо, може бути пов'язане з стійкою інфекцією підшлункової залози CVB3.

Хоча НАФПД нещодавно виявився важливим фактором дисфункції підшлункової залози, зловживання алкоголем вже давно асоціюється як з гострим, так і з хронічним панкреатитом. Зловживання алкоголем вважається етіологією приблизно в 35% випадків гострого панкреатиту у дорослих (39). Прийнято вважати, що зловживання алкоголем лише недостатньо для підбурювання гострого панкреатиту, і замість того, щоб ініціювати панкреатит, алкоголь служить для сенсибілізації підшлункової залози до некрозапального захворювання (1, 24, 29, 44). Наша лабораторія поєднала індуковану CVB3 модель гострого панкреатиту з введенням етанолу мишам. Ми виявили, що введення етанолу посилює індукований CVB3 панкреатит (8, 14, 30). Особливо важливо, що індукований CVB3 гострий панкреатит як модель алкогольного гострого панкреатиту є фізіологічно значущим для людини, поєднуючи введення етанолу з тригером, який, як відомо, викликає гострий панкреатит у людей.

5. Список літератури