Відвар лінгуйчжугану послаблює ожиріння та гепатостеатоз, спричинені дієтою, через мікробіоти кишечника

Анотація
Основна порада
Основні моменти статті
Повна стаття (PDF)
Повна стаття (HTML)
Аудіо
PubMed Central
PubMed
Перехресні посилання
Google Scholar
Подібні статті (135)
Графік процесів публікації статей (7)
Оцінка авторів (1)
Відстеження якості статті (0)

Повна стаття (HTML) (79)
Повна стаття (PDF) (28)

Ожиріння є основним фактором ризику для різних захворювань, таких як діабет, неалкогольна жирова хвороба печінки та серцево-судинні захворювання. Обмеження споживання енергії або обмеження калорій (CR) може зменшити масу тіла та покращити метаболічні параметри у пацієнтів із надмірною вагою або ожирінням. Раніше ми виявили, що відвар Лінгуйчжугана (LZD) у поєднанні з CR може ефективно знижувати рівень ліпідів у плазмі крові у пацієнтів з метаболічним синдромом. Однак механізм, що лежить в основі лікування CR та LZD, досі незрозумілий.

Дослідити, чи покращують CR і LZD метаболічні параметри, модулюючи мікробіоти кишечника.

Ми витягували водорозчинні компоненти із сировини та сушили як екстракти LZD. Восьмитижневих самців мишей C57BL/6 отримували 3-денний режим лікування, який включав 24 год голодування з подальшим видаленням екстрактів LZD протягом 2 днів поспіль з подальшою нормальною дієтою (ND) ad libitum протягом 16 тижнів. Щоб перевірити вплив мікробіоти кишечника на ожиріння, спричинене дієтою, 8-тижневі самці мишей C57BL/6 отримували трансплантацію калової мікробіоти (FMT) від мишей, оброблених CR та LZD, кожні 3 дні і годували дієтою з високим вмістом жиру (HFD) ad libitum протягом 16 тижнів. Контрольні миші отримували або сольовий соль, або FMT від мишей, що годували ND, отримували сольовий солон, як зазначено вище. Вагу тіла контролювали раз на тиждень. Споживання їжі в кожній клітці, де розміщуються п’ять мишей, реєстрували щотижня. Для моніторингу рівня глюкози в крові, загального холестерину та загальних тригліцеридів відбирали зразки крові через підщелепна кровотеча після 6 год голодування. Норму споживання кисню контролювали за допомогою метаболічних клітин. Збирали кал і витягували фекальну ДНК. Профілі мікробіоти кишечника наносили на карту шляхом метагеномного секвенування.

Ми виявили, що лікування CR та LZD суттєво знижує масу тіла мишей, яких годували ND (28,71 ± 0,29 проти 28,05 ± 0,15, P Ожиріння, діабет, ліпідний обмін, гепатостеатоз, мікробіота кишечника

Основна порада: Це дослідження показує, що обмеження калорій (CR) разом із відваром Лінгуйчжугана (LZD) лише незначно знижують масу тіла та рівень глюкози в крові при нормальному харчуванні мишей, що харчуються (ND). Тим не менше, трансплантація мікробіоти калових мас цих мишей у жирних мишей з високим вмістом жиру (HFD) сильно послаблює ожиріння, спричинене дієтою, стеатоз печінки та гіперглікемію. Більше того, ми виявили, що трансплантація мікробіоти калу збільшує швидкість споживання кисню мишами і пригнічує біосинтез печінкових ліпідів. Використовуючи метагеномне секвенування, ми далі виявили, що лікування CR та LZD змінює профіль мишей, що харчуються ND, а трансплантація мікробіоти калу - зміни, спричинені HFD, в мікробіоті кишечника. У сукупності наше дослідження підкреслює, що лікування CR та LZD надає свої метаболічні ефекти через модулююча мікробіоту кишечника.

Цитування: Liu MT, Huang YJ, Zhang TY, Tan LB, Lu XF, Qin J. Lingguizhugan decoction послаблює ожиріння, спричинене дієтою, і гепатостеатоз через мікробіота кишечника. Світ J Gastroenterol 2019; 25 (27): 3590-3606
URL:https://www.wjgnet.com/1007-9327/full/v25/i27/3590.htm
DOI:https://dx.doi.org/10.3748/wjg.v25.i27.3590

З цією метою ми вперше дослідили, чи CR у поєднанні з LZD впливає на енергію та ліпідний обмін у мишей без будь-яких порушень в обміні речовин, тобто мишей, які харчуються нормальним харчуванням (ND). Ми виявили, що комбіноване лікування CR + LZD знижує масу тіла та рівень глюкози в крові мишей, які годували ND. Для подальшого з'ясування того, чи опосередковуються такі ефекти мікробіотою, ми трансплантували мікрофлору калу мишам, що годувались ND, що отримували CR + LZD, мишам, що харчувались жирною дієтою (HFD), та вивчали їх вплив на метаболічні параметри. Цікаво, що ми виявили, що трансплантація калової мікробіоти (FMT) захищала мишей від ожиріння та гепатостеатозу, спричиненого дієтою, і знижувала рівень ліпідів у плазмі, сприяючи окисленню жирних кислот (FA) та інгібуючи біосинтез ліпідів печінки. Таким чином, наше дослідження висвітлює новий фармакологічний механізм комбінованого лікування з CR + LZD при лікуванні ожиріння та MetS.

Для збору калу мишей розміщували поодинці в звичайних клітках без будь-яких прокладок протягом 1-2 год, а кал збирали вручну і негайно охолоджували льодом до використання. Для кожної групи зважували 1 г калу, гомогенізували 2,5 мл стерилізованого сольового розчину, забуференного фосфатом, за допомогою мікропробірного гомогенізатора, і фільтрували за допомогою сито для клітин розміром 40 мкм (Thermo Scientific) для видалення великого сміття. Підготовлені фекальні гомогенати зберігали на льоду та використовували протягом 2 годин. Для FMT 200 мкл фекальних гомогенатів давали мишам перорально через 3 дні.

За тиждень до закінчення дослідження було проведено внутрішньочеревний тест на толерантність до глюкози, як описано раніше [15]. Коротко, після 16 год голодування, мишам внутрішньочеревно вводили 2 г/кг глюкози. Зразки крові відбирали з хвостової порожнини через 0, 15, 30, 60 і 120 хв після ін'єкції глюкози, а рівень глюкози в крові вимірювали за допомогою глюкометра (Johnson and Johnson). Рівні глюкози порівнювали в кожен момент часу, а загальні відмінності в глікемічному контролі порівнювали, використовуючи площу під кривою.

Метаболічну та фізичну активність мишей вимірювали за допомогою непрямого калориметра з розімкнутою ланцюгом (Oxylet, Panlab) [16]. Коротше кажучи, мишей поселяли індивідуально в метаболічних камерах, а споживання О2, вироблення СО2 та фізичну активність реєстрували з інтервалом 30 хв протягом 60 годин поспіль. Для точності записані дані за перші 12 год після того, як мишей помістили в камеру, не аналізували. Коефіцієнт дихання (RQ) розраховували як співвідношення між виробництвом CO2 та споживанням O2.

Фарбування гематоксиліном та еозином (Н та Е) та олійно-червоним O (ORO) проводили, як описано раніше (Посилання). Коротше кажучи, H та E проводили на ділянках печінки розміром 5 мкм, які були зафіксовані Буеном та вбудовані в парафін. Для фарбування ORO, яке використовувалось для виявлення нейтральних ліпідів, свіжі тканини печінки, вкладені в сполуку оптимальної температури різання, кріосекціонували товщиною 7 мкм. Після фіксації 4% параформальдегідом зрізи фарбували 0,3% ORO за стандартними процедурами та фарбували гематоксиліном. Зображення сканували за допомогою багаторежимного зчитувача Cytation 5 Cell Imaging (BioTek Instruments, США).

Для вимірювання рівнів ALT, AST, BUN та інсуліну в плазмі крові зразки крові збирали після 6-годинного голодування в кінці дослідження та попередньо очищали центрифугуванням при 3000 × g протягом 5 хв. Рівні інсуліну вимірювали за допомогою набору ELISA від ALPCO (каталог № 80-INSMSU-E01) відповідно до протоколу виробника. Діяльність ALT та AST у плазмі крові та рівні BUN вимірювали за допомогою колориметричного набору від Biosino (Китай), дотримуючись стандартного протоколу виробника.

Для імуноблотингу зразки печінки миші 50 мг гомогенізували в буфері RIPA (Beyotime, Китай) з коктейлем інгібітора протеази (Roche), використовуючи TissueLyzer (Jingxin, Китай). Гомогенати попередньо очищали центрифугуванням при 10000 × g протягом 10 хв при 4 ° C. Концентрації білка визначали за допомогою аналізу BCA (Pierce). Рівну кількість білків (20-30 мг) завантажували та розділяли на 4% -12% гелів Bis-Tris (GenScript) і переносили на мембрани PVDF за допомогою системи сухого блотування iBlot® 2 (Thermo Fisher Scientific). Потім ляпки зондували такими антитілами: Anti-ACC (1: 1000, технологія клітинної сигналізації), анти-PPARγ (1: 1000, Proteintech), анти-SCD1 (1: 500, Abcam), анти-SREBP-1c (1: 1000, Proteintech), анти-FASN (1: 1000, Proteintech), анти-β-актин (1: 5000, Proteintech), анти-мишачий IgG (1: 5000, Jackson ImmunoResearch), анти-кролячий IgG ( 1: 5000, Jacson ImmunoResearch), а потім виявлено Clarity TM Western Substrate (Bio-Rad). Інтенсивність смуги аналізували за допомогою ImageJ.

Для вимірювання вмісту ліпідів у печінці для вилучення печінкових ліпідів застосовували метод Фолча [23]. Коротше кажучи, 50 мг зразків печінки гомогенізували за допомогою TissueLyzer (60 Гц, 30 с) у суміші хлороформу та метанолу (2: 1) з подальшим додаванням метанолу, хлороформу та надчистої води. Екстраговані ліпіди сушили газом N2 і розчиняли 200 мкл PBS, що містить 1% Triton X-100. Холестерин та тригліцериди вимірювали за допомогою колориметричних наборів (Wako).

Метагеномне секвенування та аналіз були проведені Novagen (Пекін, Китай). Коротше кажучи, по 40 мг калу від кожної миші об’єднували, і ДНК витягували за допомогою автоматизованого екстрактора ДНК (Chemagic360, PelkinElmer). Концентрацію ДНК вимірювали за допомогою набору для аналізу dsDNA Qubit ® у флуорометрі Qubit ® 2.0 (Life Technologies, Каліфорнія, США), а якість ДНК перевіряли за допомогою Labchip GX Touch 24 та набору ДНК HT Labchip. Для побудови бібліотеки в якості вихідного матеріалу використовували 1 мкг ДНК на зразок. Бібліотеки секвенування були створені за допомогою NEBNext ® Ultra ™ ДНК-бібліотеки для підготовки бібліотек для Illumina (NEB, США) відповідно до рекомендацій виробника. Коди індексу були додані для атрибуції послідовностей до кожного зразка. Коротко, зразок ДНК був фрагментований обробкою ультразвуком до розміру 350 п.н., потім фрагменти ДНК були відшліфовані кінцем, A-хвостом і ліговані за допомогою повнорозмірного адаптера для секвенування Illumina з подальшим посиленням ПЛР. Нарешті, продукти ПЛР очищали (система AMPure XP), а бібліотеки аналізували на розподіл за розмірами за допомогою біоаналізатора Agilent2100 та кількісно визначали за допомогою ПЛР у реальному часі.

Для обробки та аналізу даних вихідні дані, отримані з платформи послідовності Illumina HiSeq, спочатку були попередньо оброблені за допомогою Readfq (версія 8, ht tps: //github.com/cjfields/readfq) для отримання чистих даних для подальшого аналізу. Критеріями для обробки вихідних даних були такі: (1) Вилучення, що містять низькоякісні основи (порогове значення якості за замовчуванням ≤ 38), над певною порцією (довжина за замовчуванням 40 п.н.) були видалені; (2) Видалено показники, в яких база N досягла певного відсотка (довжина за замовчуванням 10 п.н.); (3) Читання, у яких спільне перекриття певної частини з адаптером (довжина за замовчуванням 15 п.о.), були видалені. Отримані чисті дані додатково піддавали продувній передачі в базу даних хоста (миші) за допомогою Bowtie (версія 2.2.4, http://bowtiebio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) для видалення будь-яких генів, що були господарями. Для збирання метагеном з отриманих чистих даних було використано програмне забезпечення SOAPdenovo (версія 2.04, http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html). Для прогнозування генів та аналізу кількості використовувались MetaGeneMark (версія 2.10, http://topaz.gatech.edu/GeneMark) та CD-HIT (версія 4.5.8, http://www.bioinformatics.org/cd-hit) . Для передбачення таксономії DIAMOND (версія 0.9.9, https://github.com/bbuchfink/diamond), база даних NR (версія 2018-01-02, https: // http: //www.ncbi.nlm.nih. gov), програмне забезпечення MEGAN, пакет R vegan (версія 2.15.3) та програмне забезпечення LEfSe. Детальні параметри, використані в аналізі, доступні за запитом.

Всі значення були представлені як середнє значення ± SE. Для експериментів з n число ≥ 8/група, для перевірки нормальності був проведений омнібус-тест Д'Агостіно-Пірсона. Для експериментів з нижчим n Для тесту на нормальність було проведено тест Колмогорова-Смирнова. Після проходження тесту на нормальність проводили односторонній ANOVA, а потім тест Бонферроні для порівняння більш ніж двох груп. Студентський т-тест був використаний для порівняння відмінностей між двома групами. P значення восьмитижневих самців мишей C57BL/6J отримували контрольну обробку (рожеву) або обмеження калорій та відвар Лінгвічжугана (CR + LZD) (зелений) протягом 16 тижнів; n = 10 на групу. В: Вага тіла контролювався щотижнево протягом періоду дослідження, і кожна точка та похибка представляють середнє значення ± стандартна похибка; B: накопичений прийом їжі протягом експериментального періоду; С: Рівень глюкози в крові натще вимірювали на 0 і 16 тижнях; D: рівень загального холестерину в плазмі; E: Загальний рівень тригліцеридів у плазмі; F-H: Активність плазмової аланінтрасамінази (ALT) та аспартат трансамінази (AST) та співвідношення AST/ALT; I: Рівень азоту сечовини в плазмі крові. Дані оцінювались на предмет статистичної значущості за допомогою t-критерію студента і представлені таким чином: a P

Неясно, чи знижував FMT рівень печінкових ліпідів лише за рахунок збільшення окислення ліпідів. Таким чином, ми виміряли печінкову експресію ключових генів, що беруть участь у біосинтезі ліпідів. Ми виявили, що HFD підвищує експресію SREBP-1c, ACCα, FASN, SCD1 та PPARγ у печінці [24], порівняно з рівнем експресії в печінці мишей, що харчуються ND (Малюнок 4A-E). Таким чином, підвищена експресія цих ліпогенних генів пояснює збільшення відкладення ліпідів у печінці та жировій тканині. Що цікаво, FMT від мишей, оброблених CR + LZD, але не від контрольних мишей, знизив печінкову експресію цих ліпогенних генів (Фігура 4A-E). Крім того, ми виміряли кількість цих білків у ключових факторах за допомогою імуноблотингу. Відповідно до профілів експресії генів, білки SREBP-1c, ACCα, FASN, SCD-1 та PPARγ знижувались FMT (рис. 4F та G). У сукупності ці дані дозволяють припустити, що FMT також пригнічує біосинтез ліпідів у печінці, додатково пояснюючи спостереження, що вміст печінкових ліпідів зменшувався FMT.

Відвар лінгуйчжугана (LZD) у поєднанні з обмеженням їжі широко застосовується в клінічній практиці для лікування пацієнтів з порушеннями обміну речовин, такими як ожиріння, діабет, високий рівень ліпідів у плазмі крові та неалкогольна жирова хвороба печінки. Незважаючи на широке застосування та ефективність, про його механізм відомо мало.

Хоча прийнято використовувати LZD у клініці для лікування пацієнтів із порушеннями обміну речовин, відсутність знань про його механізм обмежило його використання. Уточнення фармакологічного механізму забезпечить наукові докази його використання в клініці. Недавні дослідження показали, що традиційні китайські рослинні ліки надають свій ефект шляхом модуляції мікробіоти кишечника, яка раніше не була визнана.

Щоб дослідити, чи покращує метаболічні параметри LZD у поєднанні з обмеженням їжі через модулююча мікробіоту кишечника.

Щоб відповісти на це запитання, ми вводили датчик LZD на додаток до обмеження їжі мишам, які харчувались нормальним харчуванням, і контролювали масу тіла, рівень глюкози в крові та рівень ліпідів у плазмі крові. Одночасно ми збирали кал цих мишей і гомогенізували з фізіологічним розчином. Ми давали ці фекальні гомогенати, що містять мікроби, мишам, які харчуються з високим вмістом жиру. Оскільки дієта з високим вмістом жирів збільшує масу тіла, вона спричиняє збільшення рівня ліпідів у плазмі крові та рівня глюкози в крові та спричинює ненормальне накопичення ліпідів у печінці. Таким чином, ми вивчали ефекти давання фекальних гомогенатів від мишей, які отримували ЛЗД та обмежених їжею, на метаболічні відхилення, викликані дієтою.

Ми виявили, що LZD разом із обмеженням їжі дещо знижує масу тіла та рівень глюкози в крові, але не впливає на рівень ліпідів у плазмі крові. Однак надання фекальних гомогенатів, зібраних з LZD та мишами з обмеженим вмістом їжі, значно знижує масу тіла, рівень ліпідів у плазмі крові, вміст ліпідів у печінці та рівень глюкози в крові мишей на дієті з високим вмістом жиру. Ми також виявили, що надання мишам фекальних гомогенатів значно сприяло окисленню жиру та пригнічувало синтез жиру. Використовуючи методи секвенування ДНК, ми виявили, що LZD разом із обмеженням їжі суттєво змінював склад бактерій у кишечнику.

Ми виявили, що традиційна китайська медицина, яка широко використовується, може змінити склад бактерій кишечника. Передача цих кишкових бактерій мишам з високим вмістом жиру може знизити підвищення рівня глюкози в крові, рівень ліпідів у плазмі крові, вміст ліпідів у печінці та збільшення маси тіла. Таким чином, мікроби в кишечнику є найбільш імовірною основною мішенню ЛЗД та лікування обмеженням їжі.

Наше дослідження наголошує на можливості використання бактерій для лікування метаболічних розладів, таких як ожиріння в майбутньому. Використовуючи метагеноміку, метатранскріптомічне секвенування та фекальну метаболоміку, можна ідентифікувати найважливіші бактерії та метаболіти, що лежать в основі лікування ЛЗД та обмеження їжі. Це дасть можливість культивувати ідентифіковані бактерії в природних умовах і обробити їх екстрактами LZD. Тоді надання пацієнтам таких культивованих та оброблених бактерій забезпечить подібні ефекти, як лікування LZD, тим самим зменшуючи потенційні токсичні ефекти фітотерапії.

Автори дякують членам лабораторії доктора Сі-Фен Лу за їх технічну допомогу.

Джерело рукопису: небажаний рукопис

Тип спеціальності: Гастроентерологія та гепатологія

Країна походження: Китай

Класифікація звіту з рецензуванням

Оцінка A (Відмінно): A

Клас B (Дуже добре): B

Оцінка C (добре): C, C

P-рецензент: Barzilay J, Hassan AI, Muriel P, Zhao JB S-редактор: Yan JP L-редактор: Filipodia E-редактор: Ma YJ