Від нормального до ожиріння і назад: зв’язок між номером копії мітохондріальної ДНК, статтю та індексом маси тіла

Дарія Скуратовська

1 Лабораторія імунології та клітинних біотехнологій, Балтійський федеральний університет імені Іммануеля Канта, Калінінград, 236016, Росія; ur.xednay@avonivtilasiral (L.L.); ur.xednay@naej-yram (М.В.); moc.liamg@apazodne (P.Z.)

Лариса Литвінова

Марія Вульф

Павло Затолокін

2 Відділення реконструктивної та ендоскопічної хірургії, Калінінградська обласна лікарня, Калінінград 236016, Росія

Костянтин Попадін

3 Центр мітохондріальної функціональної геноміки, Інститут живих систем, Балтійський федеральний університет ім. Імануеля Канта, Калінінград, 236040, Росія; moc.liamg@nidapopnitnatsnok

4 Центр інтегративної геноміки, Університет Лозани, 1015 Лозанна, Швейцарія

5 Швейцарський інститут біоінформатики, 1015 Лозанна, Швейцарія

Ілля Мазунін

Пов’язані дані

Анотація

Мітохондріальна ДНК (mtDNA) кодує основні субодиниці комплексів окисного фосфорилювання, а в результаті складних регуляторних перехресних зв’язків між геномами ядер та мітохондрій загальна кількість копій mtDNA відповідає вимогам кожного типу клітин. Очікується, що відхилення від фізіологічної кількості копій мтДНК будуть шкідливими і можуть спричинити деякі спадкові захворювання та нормальне старіння. Ми вивчали 46 хворих на ожиріння з діабетом 2 типу (T2DM) через рік після лапароскопічної гастректомії рукавів (LSG) та шлункового шунтування Roux-en-Y (RYGB). Результати порівнювали з пацієнтами із нормальною вагою без T2DM (контрольна група 1) (індекс маси тіла (ІМТ) = 22,5 ± 3,01 кг/м 2) та пацієнтами з ожирінням без T2DM (контрольна група 2) (ІМТ = 36 ± 3,45 кг/м 2). Ми виявили збільшення кількості копій mtDNA в клітинах пухкої оболонки, отриманих з периферичної крові, відібраних через рік після баріатричної операції. Ми також виявили, що середня кількість копій mtDNA, а також її динаміка (до та після операції) є гендерними. Наскільки нам відомо, це перший доказ відновлення числа копій mtDNA у пацієнтів із ожирінням після LSG та RYGB.

1. Вступ

2. Матеріали та методи

У це дослідження було включено 46 пацієнтів із СД2, які страждали ожирінням (11 чоловіків та 35 жінок, 47,67 ± 8,6 років, ІМТ = 48,1 ± 9,4 кг/м 2). Ці пацієнти потрапили до обласної клінічної лікарні Калінінградської області для хірургічного лікування. Наявність T2DM підтверджено на основі детального клінічного та інструментального обстеження з використанням діагностичних критеріїв Світової організації охорони здоров'я щодо цукрового діабету та проміжної гіперглікемії (1999–2013).

Пацієнти з T2DM із ожирінням були розподілені на групи за типом баріатричної операції, якій вони перенесли: 21 пацієнту було проведено ЛСГ та 25 пацієнтам було проведено RYGB. Результати порівнювали із здоровими донорами нормальної ваги без T2DM (контрольна група 1) (8 чоловіків та 10 жінок, 41,8 ± 4,6 року, ІМТ = 22,5 ± 3,01 кг/м 2) та пацієнтами з ожирінням без T2DM (контрольна група 2) (9 чоловіків та 18 жінок, 42,8 ± 8,3 року, ІМТ = 36 ± 3,45 кг/м 2) для оцінки впливу наявності/відсутності діабету 2 типу. Ми вирішили використовувати дві контрольні групи, оскільки через рік після операції у пацієнтів підвищилася mtDNA, але ІМТ не досяг нормального рівня (тобто пацієнти з нормальною вагою).

Технічний процес виконання баріатричних операцій був стандартизований відповідно до методичних рекомендацій для баріатричних хірургів. RYGB проводили з використанням техніки Лонрота.

Усі учасники дослідження дали інформовану згоду на участь у дослідницькому дослідженні. Дослідження проводилось відповідно до Гельсінської декларації Всесвітньої медичної асоціації (WMA) (2000) та Протоколу до Конвенції про права людини та біомедицину (1999). Протокол дослідження був затверджений Місцевим етичним комітетом інноваційного парку Балтійського федерального університету імені Імануеля Канта (Протокол № 4 від 23 жовтня 2013 р.).

Зразки крові відбирали до баріатричної операції та через рік після. ДНК було негайно витягнуто з усіх зразків пухкої оболонки периферичної крові за допомогою набору QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Німеччина), відповідно до інструкцій виробника. Реакція цифрової ПЛР за допомогою крапель проводилася подібно до раніше опублікованого протоколу [11]. Посередники вуглеводного обміну (глюкоза, глікований гемоглобін (HbA1c)) вимірювали на автоматичному біохімічному аналізаторі СА-180 (Furuno Electric Co., Ltd, Nishinomiya, Японія). Кількісне визначення інсуліну, греліну, шлункового гальмівного поліпептиду (GIP), глюкагоноподібного пептиду-1 (GLP-1), рецептора фактора некрозу пухлини 2 (TNFR1) та рецептора фактора некрозу пухлини 2 (TNFR2) оцінювали за допомогою потокової флуориметрії на автоматизований лазерний аналізатор (Bio-Plex ® 200, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) з використанням комерційної тест-системи Bio-Plex Pro Diabetes Human 10-Plex Assay (Bio-Rad, США) та Bio-Plex Pro ™ запалення людини Панель 1, 37-Plex (Bio-Rad, США).

Перевірку нормальності кількісного розподілу показників проводили за допомогою критерію Шапіро-Вілька. Оскільки досліджувані зразки відповідають нормальному розподілу, гіпотеза про рівність середніх значень вибірки була перевірена за допомогою t-критеріїв Стьюдента. Для оцінки значущості відмінностей між незалежними кількісними зразками, які не відповідали нормальному закону розподілу, використовували непараметричний тест Крускала-Уолліса. Для виявлення статистично значущих відмінностей між групами був проведений парний аналіз з використанням непараметричного Манна-Уітні для незалежних груп та тесту Уілкоксона для залежних груп. Для аналізу зв'язків між рівнями мтДНК та ІМТ ми використовували рангову кореляцію Спірмена.

Можливо, збільшення копій mtDNA у пацієнтів після операції RYGB (порівняно з контрольною групою 2) може бути взаємопов'язано з особливостями метаболізму післяопераційного гормону. Позитивний ефект баріатричних операцій LSG та RYGB на масу тіла та вуглеводний обмін досягається зміною харчової поведінки та виробленням певних гормонів у шлунково-кишковому тракті пацієнтів. Таким чином, у пацієнтів після хірургічного лікування ІМТ знижується, однак, згідно з літературними даними, відновлення чутливості до інсуліну передує значній зміні маси жирової тканини [18]. Існує думка, що такі гормони, як грелін та інкретини, в основному беруть участь у цьому процесі.

В результаті операції ЛСГ очне дно шлунка видаляється; він включає основний пул клітин, що продукують грелін [19,20,21]. Моделі тварин, що нокаутують рецептори Греліну, показали покращену чутливість до інсуліну, більш високий термогенез та активність мітохондрій шляхом активації сигнальних шляхів активованої АМФ протеїнкінази (AMPK) [22]. Тут ми виявили, що рівень греліну в плазмі крові знижувався у пацієнтів з T2DM після ЛСГ порівняно з передопераційними умовами (p Рисунок 1). Результати можуть свідчити про вплив греліну на нормалізацію вуглеводного обміну після баріатричної операції. Більше того, рівень греліну в плазмі крові негативно корелював з числом копій мтДНК у всіх спостережуваних пацієнтів з T2DM до та після баріатричної операції (r = −0,36, p Рисунок 1). Такі ж результати спостерігались у м’язовій тканині пацієнтів на ранніх стадіях критичного захворювання [23]. Стимулюючий ефект греліну на активність мітохондрій у нейронах був продемонстрований раніше [24]. Відповідно до позитивної кореляції рівня греліну в плазмі крові з рівнем глюкози та ІМТ при різних станах пацієнта, ми можемо припустити функціональний зв’язок між копіями мтДНК та зниженням рівня греліну після баріатричної операції. Потрібен більш ретельний аналіз у майбутньому.

Секреція GIP та GLP-1 збільшується після RYGB, і результат їх впливу на інсулін може бути основною причиною зниження рівня глюкози [25,26]. Незважаючи на підвищений рівень GIP та відсутність змін рівня GLP-1 у плазмі після RYGB порівняно із передопераційним станом у нашому дослідженні, нам не вдалося знайти жодної кореляції з числом копій mtDNA пацієнтів. Це свідчить про відсутність взаємозв'язку між кількістю копій мтДНК та інкретинами в наших дослідженнях.

Є дані, що пацієнти з ожирінням із СД2 страждають хронічним субклінічним запаленням жирової тканини [27]. Більше того, існує зв'язок між ІМТ та рівнем прозапальних цитокінів, характерних переважно для пацієнтів із СД2 [28,29]. У нашій попередній роботі ми продемонстрували кореляцію між кількістю копій мтДНК та прозапальними факторами (TNF-α) у таких пацієнтів [30]. Відповідно до цього, ми припускаємо, що збільшення кількості копій mtDNA в пухлинній оболонці периферичної крові може бути пов'язане з прозапальними факторами, що циркулюють у крові пацієнтів після операції.

Кількість копій мтДНК у клітинах крові у всіх пацієнтів відповідно до статі. Примітка: (A) Гендерні відмінності рівня мтДНК між контролями та пацієнтами до і після обох баріатричних операцій, незалежно від типу операцій. Сині ящики відповідають чоловікам, рожеві - жінкам; (B) Динаміка змін ІМТ та рівня мтДНК (кількість копій) для кожного пацієнта зображена стрілкою: початок кожної стрілки відповідає умовам до операції, а кінець кожної стрілки - умовам після операції: синій— чоловіки, рожеві - жінки, стрілки - футляри, крапки - елементи керування.

Щоб глибше дослідити зв'язок між мтДНК та ожирінням, ми проаналізували динаміку рівня мтДНК для кожного пацієнта в контексті відповідних змін ІМТ (Малюнок 2 Б: стрілки вказують на зміни ІМТ та копій мтДНК до і після баріатричного операції, незалежно від виду операцій). Як і слід було очікувати, ми спостерігали зниження ІМТ у всіх пацієнтів: абсолютно всі стрілки спрямовані вниз, що означає, що ІМТ після операції нижчий, ніж ІМТ до операції. Ми також можемо побачити, що жінки демонструють збільшення кількості копій mtDNA після обох баріатричних операцій (рожеві стрілки, p Малюнок 2 B), ми можемо відзначити, що виражені зміни ІМТ пов'язані з вираженими змінами копій mtDNA (довгі стрілки менше круті порівняно з короткими): це означає, що невеликі зміни ІМТ не пов'язані зі збільшенням мтДНК, тоді як великі зміни ІМТ пов'язані зі збільшенням рівня мтДНК. Для статистичного підтвердження цього спостереження ми співвідносимо пропорційні зміни ІМТ (контраст у ІМТ для кожного пацієнта визначався як ІМТ після операції мінус ІМТ до операції, нормалізований за допомогою ІМТ до операції) з відповідними пропорційними змінами в мтДНК (контраст в мтДНК для кожного пацієнта визначали як рівень мтДНК після операції мінус рівень мтДНК до операції, нормалізований за рівнем мтДНК до операції). Ми спостерігали незначно значущу негативну кореляцію між цими контрастами (p = 0,041; rho = -0,312, одностороння кореляція рангу Спірмена), що означає, що чим вище зміни в ІМТ, тим вище відповідні зміни в кількості копій мтДНК. Ця кореляція контрастів може призвести до функціональних причинних зв'язків між ІМТ та копіями мтДНК.

4. Висновки

Наші результати дають новаторські докази зв’язку між змінами копій mtDNA в клітинах пальфічної оболонки периферичної крові та певними параметрами метаболізму вуглеводів (рівень глюкози та HbA1c) під час змін ІМТ пацієнта через рік після баріатричної операції RYGB та LSG. Зменшення кількості копій мтДНК може бути основною причиною, що передує розвитку діабету 2 типу, що узгоджується з нашими попередніми дослідженнями [30] та роботами інших авторів, що демонструють зниження копій мтДНК у пацієнтів з діабетом 2 типу та відновленням функцій мітохондрій. і копії мтДНК після схуднення [36,37]. Кількість копії mtDNA є мірою функції мітохондрій та відображає пошкодження клітин, спричинене окислювачем [38]; його також можна використовувати для діагностики метаболічних відхилень у пацієнтів. Ще одне спостереження, яке буде цікавим для розуміння в майбутньому, полягає в тому, чому ми не спостерігаємо ефекту відновлення мтДНК у чоловіків. Це може бути пов'язано з нашим відносно обмеженим обсягом вибірки та спочатку низьким рівнем мтДНК у чоловіків (навіть у контролі), що робить будь-які зміни менш вираженими, або через менш оптимальну регуляцію рівня мтДНК у чоловіків через розслаблений вибір властивостей мтДНК у чоловіки [39].

Додаткові матеріали

Далі доступні в Інтернеті за адресою https://www.mdpi.com/2073-4409/8/5/430/s1, таблиця S1. Рівень гормонів інкретину та греліну у пацієнтів після баріатричних операцій LSG та RYGB, [Me (Q1 – Q3)]; Таблиця S2. Рівень надсімейних рецепторів TNF у пацієнтів після баріатричних операцій LSG та RYGB, [Me (Q1 – Q3)].

Внески автора

Концептуалізація, І.М. та Л.Л .; хірургія, П.З .; Збір даних, аналіз та інтерпретація даних, D.S., M.V. і К.П., написання — огляд та редагування, Д.С., К.П. та І.М.

Фінансування

Дослідження підтримано Російським науковим фондом [No. 17-75-20015 до І.М. (підхід ddPCR)], Російський фонд фундаментальних досліджень [No. 18-015-00084-a до L.L. (набір та класифікація пацієнтів), No 18-29-13055 до K.P. (статистична підтримка дослідження)], Російського фонду фундаментальних досліджень та KLG [№19-415-393004-r_mol_a до D.S. (біохімія крові), No19-44-390005-r_a до D.S. (флуориметрія потоку)].

Конфлікт інтересів

Автори не заявляють конфлікту інтересів.