Тіопролін пригнічує розвиток аденокарциноми стравоходу, індуковану гастродуоденальним рефлюксом у щурів

Хітомі Кумагай, Кен-Ічі Мукайшо, Хіроюкі Сугіхара, Коічі Міва, Гаку Ямамото, Таканорі Хатторі, Тіопролін пригнічує розвиток аденокарциноми стравоходу, викликаної гастродуоденальним рефлюксом у щурів, Канцерогенез, том 25, випуск 5, травень 2007, сторінка 5: //doi.org/10.1093/carcin/bgh067

Анотація

Кілька епідеміологічних когортних досліджень припустили, що дуодено-гастроезофагеальний рефлюкс сам по собі індукує стравохід Барретта, що призводить до підвищеного ризику розвитку аденокарциноми стравоходу (EAC). Однак точні причинні фактори, що стоять за EAC, залишаються незрозумілими. Нещодавно ми розробили нову модель рефлюксу вмісту дванадцятипалої кишки, яка зберігала нормальну роботу шлунка. У цій моделі вміст дванадцятипалої кишки повернувся назад у стравохід і шлунок, що призвело до повторного повторного потрапляння в стравохід через місце езофагоєюностомії. Для з'ясування факторів, що лежать в основі розвитку ЕАК, до нових моделей рефлюксу застосовували тіазолідин-4-карбонову кислоту (тіопролін, TPRO) як поглинач нітритів та як зонд для виявлення активних видів азоту (РНС). Після операції 31 тварина була розділена на дві групи відповідно до дієти. Тваринам, що належали до контрольної групи, давали нормальний раціон (n = 18), тоді як групі TPRO давали їжу, що містить 0,5% TPRO (n = 13). Всі зрізи стравоходу в обох групах досліджували за допомогою фарбування гематоксиліном та еозином та імуногістохімічного аналізу індуцибельної синтази оксиду азоту (iNOS). ЕАК розвивались у 7 з 18 щурів (38,9%) контрольної групи, тоді як у групі TPRO не виявляли ЕАК (точний тест Фішера, Р

Вступ

Гастроезофагеальна рефлюксна хвороба (ГЕРХ) за останні десятиліття стала поширеним захворюванням у США та Західній Європі (1, 2). Стравохід Барретта (BE) був пов'язаний із істотно підвищеним ризиком аденокарциноми стравоходу (EAC) і вважався наслідком тривалої кислотної травми (3 - 6). Однак було виявлено, що у великої популяції пацієнтів з ВЕ спостерігаються періоди не тільки шлункової кислоти, але й опромінення стравоходу дванадцятипалої кишки (7 - 12). І навпаки, кілька дослідників повідомляли, що дуодено-гастроезофагеальний рефлюкс сам по собі може спонукати BE до утворення EAC у щурів (13 - 15).

Щоб з'ясувати канцерогенні ефекти вмісту дванадцятипалої кишки, багато дослідників зверталися до факторів жовчних кислот і панкреатичного соку (16, 17), а інші посилалися на наявність бактеріальної флори в соку дванадцятипалої кишки, здатної каталізувати ендогенні реакції з утворенням нітрозосполук ( 18, 19). Нещодавно було зареєстровано надмірну експресію білка індукованої оксиду азоту синтази (iNOS) у карциномі стравоходу людей та тварин (20 - 22) та активних азотних формах (RNS), таких як оксид азоту (NO), пероксинітрит (ONOO -) та нітрозосполуки пропонується відігравати важливу роль у процесі неопластичної трансформації стравоходу.

Тіазолідин-4-карбонова кислота (тіопролін, TPRO) є циклічною сірковмісною амінокислотою і є продуктом конденсації цистеїну та формальдегіду (23, 24). TPRO є ефективним агентом, що затримує нітрити, як in vitro, так і в організмі людини, і є дуже чутливим зондом для оцінки здатності до нітрозування (25 - 27). Якщо РНС при гастродуоденальному рефлюксі або нітрозативні пошкодження сприяють канцерогенезу стравоходу, TPRO як поглинач нітритів може інгібувати розвиток ЕАК.

Нещодавно ми розробили нову модель рефлюксу вмісту дванадцятипалої кишки, яка зберігала нормальну роботу шлунка (15). Модель демонструє схожість із ситуацією у пацієнтів з дуодено-гастроезофагеальним рефлюксом, викликаючи як вміст дванадцятипалої кишки, так і рефлюкс шлункового соку в стравохід. Для з'ясування причинних факторів, що лежать в основі ЕАЦ, ми дослідили, чи може TPRO інгібувати ЕАС, викликаний дуодено-шлунково-стравохідним рефлюксом, використовуючи цю нову модель щурів.

Матеріали і методи

Тварина модель

Хірургічна процедура рефлюксу шлункового та дуоденального вмісту. Т, зв’язка Трейца. Однією з переваг цієї моделі в порівнянні з іншими моделями є нормальна робота шлунка та збереження нормального харчового статусу. Вміст дванадцятипалої кишки неодноразово надходить назад у стравохід і шлунок через місце езофагоєюностомії.

Гістологічне дослідження

Відразу після смерті видалили весь стравохід, ділянку анастомозу та тонку кишку довжиною 5 мм. Стравохід поздовжньо розкривали, розкладали на пробковій пластині слизовою стороною догори для макроскопічного дослідження, а потім фіксували у 10% нейтральному буферизованому формаліні у забуференному фосфатом сольовому розчині. Через 4 год фіксації видалену тканину розрізали послідовно на зрізи 3 мм уздовж поздовжньої осі. З кожної проби стравоходу було зроблено три зрізи. Зрізи вбудовували в парафін і розрізали на ділянки 4 мкм. Всі зрізи фарбували гематоксиліном та еозином (ВІН).

Важкий езофагіт характеризувався як гіперпластичний, коли плоский епітелій потовщувався при нормальному дозріванні та гіперкератозі, або регенеративний, коли плоский епітелій виявляв збільшену висоту соскових пластинок пластинки та гіперплазію базальноклітинних клітин (28). BE, плоскоклітинна дисплазія, аденосквамозна карцинома, EAC та плоскоклітинний рак стравоходу (ESCC) класифікували за класифікацією ВООЗ (29). Ми досліджували всю довжину стравоходу у всіх випадках. Якщо деякі ураження, згадані вище, були частково виявлені, ми зарахували їх як позитивні випадки.

Імуногістохімічний аналіз на iNOS

Серійні зрізи фарбування ВІН депарафінізували, а активність ендогенної пероксидази гасили інкубацією в 0,3% H 2 O 2 в метанолі протягом 30 хв при кімнатній температурі. Потім зрізи мікрохвилювали в цитратному буфері, рН 6,1, протягом 40 хв для отримання антигену. Неспецифічне зв'язування блокували 10% кролячої сироватки протягом 10 хв. Після блокування зрізи інкубували з мишачими моноклональними антитілами до iNOS (NOS2, C-11, розведення 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) протягом ночі при 4 ° C. Нормальний мишачий IgG служив негативним контролем. Наступного дня імунореактивність була виявлена шляхом інкубації з біотинільованим кролячим анти-мишачим антитілом та стрептавідин-біотин-пероксидазним комплексом [Histofine SAB-PO (M) Kit; Нічірей, Токіо, Японія], по 20 хв. Потім колір розробляли з використанням 3,3′-діамінобензидину. Ядра були злегка забруднені гематоксиліном.

Статистичний аналіз

Статистичну оцінку проводили за допомогою точного критерію Фішера. Значення P Таблиця I. Важкий езофагіт з базаліозною гіперплазією був виявлений у всіх щурів контрольної групи. Тяжка дисплазія стравоходу (66,7%), виразка стравоходу (83,3%), спеціалізований колоноподібний епітелій BE (77,8%) (малюнок 2A), EAC (38,9%) (малюнок 2B), аденосквамозна карцинома (16,7%) (малюнок 2C) та ESCC (5,6%) (Малюнок 2D) також спостерігалися у контрольній групі. Майже всі ці ураження були виявлені в групі TPRO. Хоча езофагіт був виявлений у трьох щурів групи TPRO, ступінь запалення був незначним порівняно з контрольною групою. Важкий езофагіт розвинувся у всіх інших щурів групи TPRO. EAC та аденосквамозні карциноми не спостерігались у групі TPRO, а частота виразки стравоходу та EAC була значно меншою у групі TPRO, ніж у контрольній групі (P Таблиця I.

Гістопатологічні результати в обох групах та статистична оцінка у кожному ураженні

Знахідка. Позитивні випадки/загалом на 70 тижні (%). . P . . TPRO. Контроль . .

Важкий езофагіт	10/13 (76,9)	18/18 (100)	0,064
Плоскоклітинна дисплазія (важка форма)	4/13 (30,8)	12/18 (66,7)	0,117
Виразка стравоходу	6/13 (46,2)	15/18 (83,3)	0,036
Спеціалізований стовпчастий епітелій	6/13 (46,2)	14/18 (77,8)	0,076
Аденокарцинома стравоходу	0/13 (0)	7/18 (38,9)	0,012
Аденосквамозна карцинома	0/13 (0)	3/18 (16,7)	0,182
Плоскоклітинний рак	1/13 (7,7)	1/18 (5.6)	0,671

Знахідка. Позитивні випадки/загалом на 70 тижні (%). . P . . TPRO. Контроль . .

Важкий езофагіт	10/13 (76,9)	18/18 (100)	0,064
Плоскоклітинна дисплазія (важка форма)	4/13 (30,8)	12/18 (66,7)	0,117
Виразка стравоходу	6/13 (46,2)	15/18 (83,3)	0,036
Спеціалізований стовпчастий епітелій	6/13 (46,2)	14/18 (77,8)	0,076
Аденокарцинома стравоходу	0/13 (0)	7/18 (38,9)	0,012
Аденосквамозна карцинома	0/13 (0)	3/18 (16,7)	0,182
Плоскоклітинний рак	1/13 (7,7)	1/18 (5.6)	0,671

Точний тест Фішера використовували для статистичної оцінки. Значення Р

Гістопатологічні результати в обох групах та статистична оцінка у кожному ураженні

Знахідка. Позитивні випадки/загалом на 70 тижні (%). . P . . TPRO. Контроль . .

Важкий езофагіт	10/13 (76,9)	18/18 (100)	0,064
Плоскоклітинна дисплазія (важка форма)	4/13 (30,8)	12/18 (66,7)	0,117
Виразка стравоходу	6/13 (46,2)	15/18 (83,3)	0,036
Спеціалізований стовпчастий епітелій	6/13 (46,2)	14/18 (77,8)	0,076
Аденокарцинома стравоходу	0/13 (0)	7/18 (38,9)	0,012
Аденосквамозна карцинома	0/13 (0)	3/18 (16,7)	0,182
Плоскоклітинний рак	1/13 (7,7)	1/18 (5.6)	0,671

Знахідка. Позитивні випадки/загалом на 70 тижні (%). . P . . TPRO. Контроль . .

Важкий езофагіт	10/13 (76,9)	18/18 (100)	0,064
Плоскоклітинна дисплазія (важка форма)	4/13 (30,8)	12/18 (66,7)	0,117
Виразка стравоходу	6/13 (46,2)	15/18 (83,3)	0,036
Спеціалізований стовпчастий епітелій	6/13 (46,2)	14/18 (77,8)	0,076
Аденокарцинома стравоходу	0/13 (0)	7/18 (38,9)	0,012
Аденосквамозна карцинома	0/13 (0)	3/18 (16,7)	0,182
Плоскоклітинний рак	1/13 (7,7)	1/18 (5.6)	0,671

Точний тест Фішера використовували для статистичної оцінки. Значення Р

І навпаки, ESCC був виявлений у 1 з 18 щурів (5,6%) контрольної групи та у 1 з 13 щурів (7,7%) групи TPRO. Сильне запалення було виявлено в тканинах, що прилягають до ESCC. Частота ESCC не суттєво відрізнялася між двома групами (P = 0,671).

Не було експресії білка iNOS у сусідньому нормальному або плоскоклітинному епітелії з базаліозною гіперплазією порівняно з інтенсивним фарбуванням BE як у контрольній, так і в групі TPRO (рис. 3А та В). Білок iNOS був незначно виражений в EAC і аденосквамозних карциномах у контрольній групі та ESCC в обох групах (Малюнок 3C і D).

Імуногістохімія iNOS при різних ураженнях. INOS, × 400. Хоча білок iNOS не експресується в нормальному плоскоклітинному епітелії стравоходу, він сильно виражений у більшості ВЕ обох контрольних груп ( A ) та групи TPRO ( B ). білок iNOS незначно виражений в EAC ( C. ) та ESCC ( D ) у контрольній групі. INOS також надмірно експресувався в макрофагах усіх секцій.

Обговорення

Незважаючи на прогрес у розумінні взаємозв'язку між ЕАК та ГЕРХ, мало досліджень досліджували основні причини. Для вивчення BE та EAC було розроблено кілька моделей тварин із використанням хірургічних методів (13 - 15, 30 - 32). Серед них було показано, що лише вміст дванадцятипалої кишки викликає ЕАК в моделі езофагоєюностомії з резекцією шлунка (32). Тому вміст дванадцятипалої кишки повинен відігравати вирішальну роль у канцерогенезі, що веде до ЕАК.

N-нітрозосполуки вважаються одним із причинних факторів злоякісних захворювань травного тракту. Існують експериментальні дані, що дві нітрозовані холеві кислоти, N-нітрозо-глікохолева кислота (GCA) та N-нітрозо-таурохолева кислота (TCA), спричиняють канцерогенез шлунка у щурів (16). З іншого боку, Корреа та ін. припустили, що ахлоргідрія, індукована атрофічним гастритом або операцією на шлунку, дозволяє надмірно розростатись мікрофлорою нітратно-відновними бактеріями, які перетворюють харчовий нітрат у нітрит. Представляється ймовірним, що нітрит виробляється бактеріальною флорою в дванадцятипалій кишці після операції зворотного холодильника, яка поєднується з амінами та амідами у продуктах, утворюючи N-нітрозосполуки (33), викликаючи канцерогенез EAC.

З іншого боку, також повідомляється, що iNOS надмірно експресується при раку стравоходу людей і тварин (20 - 22), і добре відомо, що РНС, такі як NO, ONOO - та нітрозосполуки, причетні до патофізіології запалення та канцерогенез (34). Однак нещодавнє дослідження не змогло продемонструвати присутність будь-якого TCA або GCA, і жодних інших нітрозопохідних не вдалося виявити в будь-яких зразках моделей тварин з рефлюксом (28). Причиною цих розбіжностей має бути те, що РНС нестабільні і в дуже малих кількостях трапляються в стравоході моделей рефлюксу щурів. Для з’ясування ефектів РНС, отриманих із жовчних кислот та нітрозосполук, що продукуються бактеріальною флорою, при зворотному зворотному введенні вмісту шлунку та дванадцятипалої кишки »ми оцінили інгібуючий ефект TPRO як поглинача нітритів та як чутливого зонда для опосередкованого виявлення РНС.

Всюдисуща сигнальна молекула NO синтезується ферментами оксиду азоту синтази: iNOS є первинною синтазою оксиду азоту, відповідальною за підвищене вироблення NO під час запалення. NO пов'язаний з ранніми подіями в пухлиногенному процесі, включаючи пошкодження ДНК, перекисне окислення ліпідів та регуляцію запалення (35, 36), що може спричинити пухлинне зростання. У цьому дослідженні TPRO пригнічувало розвиток EAC, а білок iNOS був надмірно експресованим у ВЕ як контрольної, так і групи TPRO. TPRO не міг придушити надмірну експресію iNOS, і наші результати показали, що механізм, за допомогою якого TPRO інгібує канцерогенез стравоходу, викликаний дуоденогастральним рефлюксом, може бути узагальнений наступним чином. TPRO - агент, що захоплює нітрити, завдяки своїй нітрозуючій здатності інгібує не тільки вироблення нітрозосполук нітрит-редукуючими бактеріями, але й РНС, таких як NO, ONOO - та N-нітрозосполуки, отримані внаслідок рефлюксу дуоденального вмісту. Наше сучасне дослідження не змогло виявити жодних RNS або нітрозосполук. Однак можна припустити, що РНС, отримані із вмісту дванадцятипалої кишки та нітрозосполук, що продукуються бактеріальною флорою, відіграють важливу роль у розвитку ЕАЦ.

Широко визнано, що ESCC асоціюється з курінням та алкоголем (37 - 40). Повідомляється, що ризик ESCC не пов'язаний з гастроезофагеальним рефлюксом. Особи з давніми та важкими симптомами рефлюксу мають коефіцієнт шансів 43,5 для аденокарциноми стравоходу та 1,1 для ESCC (3). Наведені результати дозволяють припустити, що EAC пов'язаний з RNS, що походить від жовчних кислот у стравоході. Деякі попередні дослідження, на додаток до цього дослідження, припускають, що ESCC може бути викликаний лише рефлюксом вмісту дванадцятипалої кишки. Однак, незважаючи на зниження частоти EAC, частота ESCC не суттєво змінилася в групі TPRO. Ці результати дозволяють припустити, що основні причинні фактори різняться між ESCC та EAC.