Системне запалення при м’язовій дистрофії Дюшенна: асоціація з м’язовою функцією та станом харчування

1 Laboratorio de Biología Molecular, Unidad de Investigación Médica en Nutrición, Hospital de Pediatría, Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS, 4th Floor, Avenida Cuauhtémoc No. 330, Colonia Doctores, Delegación Cuauhtémoc, 06725 México, Mexico, Мексика

2 Servicio de Electrodiagnóstico y Distrofia Muscular, Національний інститут реабілітації, Мексика, Мексика, Мексика

Анотація

1. Вступ

У хворих на ДМД у ранньому дитинстві зазвичай спостерігаються генералізовані затримки руху та труднощі з ходою. М'язова слабкість прогресує, спричиняючи втрату амбулації до раннього підліткового віку (у віці від 9 до 12 років) [1]. Деякі шкали оцінки, такі як шкала Віньоса, використовувались для оцінки рухової функції нервово-м'язових захворювань. Шкала Віньйоса надає інформацію про ступінь функціональної залежності пацієнта та вимірює функції нижніх кінцівок [8]. Для підтвердження цієї оцінки використовуються клінічні циркулюючі біомаркери, такі як креатинкіназа (КК), де високий рівень КК відображає пошкодження м’язів. Однак важливо врахувати, що рівні CK не є надійними, оскільки вони значно варіюються в ряді незалежних стресових умов, не обов'язково пов'язаних з пошкодженням м'язів [9].

Крім того, запальний процес може вичерпати цикли дегенерації та регенерації м’язового волокна, провокуючи заміщення м’язових волокон сполучною та жировою тканинами [10]. Жирова тканина, накопичена в м’язовій тканині, може призвести до метаболічних змін, таких як ожиріння. Загальновідомо, що у пацієнтів з ДМД ожиріння розвивається у віці від 7 років [11] не тільки через лікування глюкокортикоїдами, про що ми повідомляли раніше. Вибірка хворих на ДМД (

), які не приймали ліки, включаючи глюкокортикоїди, продемонстрували 18,3% недостатньої ваги, 22,7% надмірної ваги та 68% ожиріння [12]. Загальновідомо, що ожиріння пов’язане із слабким запаленням білої жирової тканини через секрецію прозапальних цитокінів, таких як TNF-α, ІЛ-1 та ІЛ-6 [13–15]. Таким же чином С-реактивний білок (СРБ) також підвищується в сироватці крові осіб, що страждають ожирінням. Хоча CRP не є цитокіном, він є корисним маркером запалення при ожирінні [15, 16].

Іншими молекулами, пов’язаними з ожирінням, є лептин та адипонектин. Показано, що лептин підвищується у дітей із ожирінням, тоді як адипонектин знижений. Крім того, лептин має позитивний зв’язок із СРБ і пов’язаний із кількістю жиру в організмі [16].

Хронічне запалення, спричинене пошкодженням м’язів або ожирінням у хворих на ДМД, має важливий вплив на прогресування захворювання [10]. Виявлення запального статусу під час прогресування дистрофії є клінічно важливим, оскільки це буде корисним для виявлення ступеня пошкодження м’язів, збільшуючи можливість пропонувати ранні втручання незалежно від походження запалення, пошкодження м’язів чи ожиріння. Це має важливий вплив на хід клінічних характеристик у хворих на ДМД.

Таким чином, метою цього дослідження було оцінити, чи існує зв'язок між системним запаленням із функцією м'язів та станом харчування у хворих на ДМД.

2. Матеріали та методи

2.1. Предмети та методи

Дослідження було проведено в лабораторії молекулярної біології, відділі медичних досліджень з питань харчування, дитячій лікарні, Centro Medico Nacional Siglo XXI (CMN SXXI), Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS). Усі пацієнти з ДМД, яких спостерігали в амбулаторній службі електродіагностичної м’язової дистрофії Національного інституту реабілітації, були набрані для проведення поперечного перерізу між січнем 2011 року та груднем 2013 року. Суб’єкти з клінічним діагнозом ДМД були кандидатами для участі у дослідженні та підтверджуючої молекулярної діагностики дистрофії проводили, як описано в недавньому звіті у тих самих пацієнтів [12]. Отже, до цього дослідження було включено 66 пацієнтів (у віці 4–18 років) із підтвердженим діагнозом дистрофії. Діти не були включені, якщо вони отримували терапію кортикостероїдами. Жоден з пацієнтів не приймав ліки під час дослідження.

Дослідження було схвалено інституційним комітетом з етики IMSS. Батьки та пацієнти отримали пояснення щодо основ дослідження, процедур, пільг, права на конфіденційність та права відмовитись від дослідження, якщо вони бажають. Усі батьки надали письмову інформовану згоду, дотримуючись вказівок інституційного комітету з питань людських питань.

Через 12 год швидкого ночі у кожного пацієнта збирали периферичну кров у вакутейнері без антикоагулянта для кількісного визначення цитокінів TNF-α, IL-6, IL-1, CRP та CK. Зразки сироватки витримували при -70 ° C до аналізу. Потім медичний анамнез було отримано навченим персоналом за допомогою шкали Віньоса. Нарешті, були виміряні антропометричні вимірювання, такі як вага, зріст та склад тіла за допомогою двоенергетичної рентгенівської абсорбціометрії (DEXA).

2.2. Вимірювання шкали Vignos

Існують різні процедури оцінки функції м’язів у хворих на ДМД. Однією з найбільш часто використовуваних є шкала Віньоса, яка вимірює функції нижніх кінцівок. Це безболісно і легко оцінити, а час завершення короткий. Діапазон шкали класифікується від 1 до 10 наступним чином [19]: (1) ходить і піднімається по сходах без сторонньої допомоги, (2) йде і піднімається по сходах за допомогою перил, (3) ходить і піднімається по сходах повільно за допомогою перил (> 25 сек для семи стандартних сходинок), (4) ходить без допомоги і піднімається зі стільця, але не може піднятися по сходах, (5) ходить без допомоги, але не може піднятися зі стільця або піднятися по сходах, (6) ходить лише за допомогою або ходить самостійно з довгими брекетами для ніг, (7) ходить у довгих брекетах, але вимагає допомоги для рівноваги, (8) стоїть у довгих брекетах, але не може ходити навіть за допомогою, (9) прикутий до інвалідного крісла, (10) прикутий до ліжка.

На основі хронологічних функціональних стадій пацієнти класифікувались на три групи за шкалою Віньоса: Група А, що включає пацієнтів з незалежна амбулаторія (діапазон 1–5); Група В, до якої входять пацієнти з допоміжна амбулаторія (діапазон 6–8); та Група С, до якої входять пацієнти з інвалідний візок-обмежена рухливість (діапазон 9-10) [20].

2.3. Антропометричні вимірювання

Вимірювання маси тіла (кг) та зросту (м) проводив навчений персонал. Для випробовуваних, які могли стояти прямо, висоту вимірювали за допомогою настінного стадіометра (модель 208, Seca). Для випробовуваних, які не можуть стояти прямо, довжину вимірювали на плоскому столі, обстежуючи лежачи. Вагу амбулаторних пацієнтів вимірювали за допомогою цифрової шкали Tanita (модель BWB-700), а для пацієнтів, прив'язаних до інвалідних візків, вимірювали за допомогою ваги на інвалідному візку (модель 954), а суб'єкт носив легкий одяг і не взував.

У цьому дослідженні пацієнтів класифікували відповідно до їх харчового стану. Діагноз надмірної ваги та ожиріння був отриманий за допомогою індексу маси тіла (ІМТ), вираженого у процентилях. Діти з ІМТ ≤ 5-го процентиля були класифіковані як недостатня вага; ті з ІМТ> 5-го, але

. Розподіл досліджуваних змінних досліджували за допомогою критерію Шапіро-Вілька. Аналіз відмінностей між групами проводився з одностороннім дисперсійним аналізом із використанням Bonferroni’s або Dunnet post hoc. Для даних, які зазвичай не розподіляються, застосовуються непараметричні статистичні дані, такі як Крускал-Уолліс та Манн-Уітні

використовували тест для виявлення відмінностей між групами.

3. Результати

3.1. Предмети вивчення

У це дослідження було включено 66 пацієнтів з клінічним та молекулярним діагнозом ДМД. У таблиці 1 узагальнено клінічні, антропометричні та біохімічні показники хворих на ДМД. У цьому зразковому дослідженні вік пацієнтів був

років (середнє значення ± SD); 18 пацієнтів були інвалідами на візках. Середнє значення шкали Віньоса вказує на те, що пацієнти здатні ходити і підніматися сходами, але з труднощами. Згідно з CDC, у пацієнтів із нормальною вагою ІМТ становить. З іншого боку, як і очікувалось, середня концентрація CK (

U/L) підвищений щодо нормальних значень.

3.2. Системне запалення та функція м’язів при ДМД

Оскільки хронічне запалення пов’язане з пошкодженням м’язів, що впливає на прогрес дистрофії Дюшенна, ми вирішили класифікувати досліджувану популяцію відповідно до функціонального стану м’язів за допомогою шкали Віньйоса.

Як і очікувалось, наші результати показують, що у пацієнтів з незалежною амбулацією (шкала Вігноса А) (табл. 2) була вища концентрація прозапальних цитокінів IL-1 та TNF-α у порівнянні з пацієнтами з обмеженою рухливістю (шкала Віньоса А). У тому ж сенсі CK, біомаркер пошкодження м’язів, також збільшується в тій самій групі порівняно з групами шкал Віньйоса A та B. На відміну від цього, у пацієнтів з обмеженою рухливістю на візках (шкала Vignos C) нижча концентрація провоспалительных цитокінів (IL-1 та TNF-α) та CK у порівнянні з групою шкали А Vignos. Тим не менше, різниці в IL-6 серед груп не спостерігалось.

Концентрація IL-1 знизилась у чотири рази у групі шкали Vignos шкали C у порівнянні з групою шкали Vignos шкали A та зменшилася шість разів у групі шкали B Vignos. Щодо ФНП-α, його концентрація зменшилася на одну у групі шкали Vignos C порівняно з групою шкали A Vignos. Концентрація CK була зменшена в чотири рази в групі шкали Vignos за шкалою A Vignos (табл. 2).

Лептин та СРБ зросли у 3 та 5 разів відповідно у групі шкали С Vignos порівняно з групою шкали A Vignos. На відміну від цього, різниці в концентрації адипонектину серед груп не виявлено (Таблиця 2).

Відповідно, у пацієнтів із групи шкал С за віньосом найвищий відсоток жиру, маси тіла та сухої маси тіла порівняно з пацієнтами з кращою функцією м’язів (табл. 2). Хоча як нежирна, так і жирова маса демонстрували більший приріст у групі шкали Vignos, ніж у групі шкали A Vignos, вона не спостерігається в тій же пропорції. У групі шкали Vignos A ми можемо спостерігати, що кількість худої маси тіла (кг) майже втричі перевищує масу жиру (kg), але в групі C шкали Vignos частка між нежирною та жировою масою тіла (кг) становить подібні (таблиця 2).

3.3. Системне запалення та стан харчування при DMD

Ми не спостерігали значних відмінностей у концентрації прозапальних цитокінів, таких як IL-1, IL-6 та TNF-α серед груп з різним харчовим статусом. Ці результати дозволяють припустити, що запальний статус, що виробляється цитокінами, є подібним, незалежно від стану харчування пацієнтів. У тому ж сенсі не виявлено відмінностей у віці, концентрації СК та шкалі Віньйоса серед рівнів поживності. На відміну від них, як очікувалося, концентрація СРБ у пацієнтів із надмірною вагою/ожирінням була вищою, ніж у інших двох групах (таблиця 3). Відповідно, маса тіла, жирова маса, нежирна маса та лептин значно зросли () у хлопчиків із надмірною вагою/ожирінням у порівнянні з пацієнтами зі здоровою вагою (табл. 3). Збільшення цих показників ожиріння добре відомо, хоча різниці в концентрації адипонектину серед груп поживного стану не спостерігалось (табл. 3).

4. Обговорення

Запалення відіграє головну роль у розвитку патології при ДМД. Хоча загальновідомо, що хронічне та загострене запалення може спровокувати втрату м'язової регенерації, на сьогодні недостатньо досліджень на людях, які б виявили, чи існує зв'язок між системним запаленням з функцією м'язів та станом харчування у хворих на ДМД. Результати цього дослідження дозволяють припустити, що системне запалення пов’язане з функцією м’язів у пацієнтів із СДМ.

Оскільки біопсія м’язів є інвазивною процедурою, немає інформації про запалення під час прогресування пошкодження м’язів хворих на ДМД. Отже, намагаючись неінвазивно визначити запальний процес дистрофії протягом еволюції, ми проаналізували запальні молекули в сироватці крові. Хоча загальновідомо, що запалення при ДМД в основному локалізується в м’язових волокнах із пошкоджених м’язів, результати цього дослідження змушують нас розглядати деякі цитокіни як біомаркери системного запалення, що може свідчити про пошкодження м’язів.

4.1. Системне запалення та функція м’язів при ДМД

Запалення має важливий вплив на фізіопатологію ДМД, де клітини імунології виділяють цитокіни, які посилюють процес запалення. Загострення запалення може спровокувати втрату м’язової регенерації та зменшення м’язової маси; отже, відбувається втрата м’язової функції.

Наші результати показують, що прозапальні цитокіни (IL-1 та TNF-α) знижуються в сироватці крові пацієнтів з меншою м’язовою функцією. Добре відомо, що цитокіни підвищені у дистрофічних хворих порівняно зі здоровими суб'єктами. Наприклад, TNF-α концентрація у сироватці крові хворих на ДМД збільшується у вісім разів у порівнянні зі здоровими хлопцями (

проти пг/мл) того ж віку (років) [18]. IL-6 також підвищений у сироватці крові осіб з ДМД (пг/мл) порівняно зі здоровими суб'єктами (пг/мл) [7]. Отже, цитокіни можуть мати значний вплив на запальний процес. Є деякі дослідження, які пропонують кореляцію між експресією запального цитокіну та функцією м’язів при ДМД. де Паскуале та ін. продемонстрував більш високу експресію прозапального цитокіну (IL-17) при біопсії м’язів у хворих на ДМД з нижчим руховим результатом, оціненим за шкалою оцінки амбулаторної оцінки North Star (NSAA), припускаючи, що рівні мРНК IL-17 та функціональний результат негативно пов’язані [6].

Згідно з цими висновками, КК також був знижений у тих самих пацієнтів. Повідомлялося, що КК зменшується у пацієнтів старшого віку [21, 22]. Сайто та ін. зареєстровано у молодих пацієнтів (20 років (12 нг/л) [4].

На основі цих досліджень і згідно з нашими результатами ми припускаємо, що концентрація цитокінів (маркери запалення в сироватці крові) особливо підвищується на ранній стадії захворювання, наприклад, у молодих хворих на ДМД із незалежною амбулацією. Ця пропозиція також базується на інших дослідженнях [23–25], де автори описали, що кількість клітин запалення зменшується в м’язовій тканині хворих на дистрофію після віку 8 років, і кількість цих клітин більша в перші роки життя пацієнта. Однак важливо враховувати, що м’язові волокна сприяють запаленню завдяки своїй здатності виробляти цитокіни, як це демонструється в клітинах дистрофічних та недистрофічних мишей. Клітинні лінії міоцитів дають і секретують різні цитокіни в середовищі, такі як IL-1, IL-6 та TNF-α і посилають сигнали м’язу для синтезу додаткових цитокінів [26–28]. Тому молоді пацієнти з кращою м’язовою функцією мають більше м’язової маси з вищим продукуванням цитокінів. Концентрація цих цитокінів у сироватці збільшена порівняно з пацієнтами з меншою функцією м’язів.

На підставі цих досліджень і тому, що ми спостерігали, що пацієнти з найбільш ураженою функцією м'язів (обмежена рухливість інвалідного візка) мають найнижчу концентрацію IL-1, TNF-α, та CK порівняно з пацієнтами з меншим пошкодженням м’язів (незалежна амбулаторна обробка), ми припустили, що зниження концентрації цих цитокінів та CK може бути наслідком втрати м’язів у пацієнтів з ДМД. Цю гіпотезу також підтримують Емері та Мунтоні, які припускають, що зниження рівня КК у сироватці крові хворих на ДМД пов'язане зі зниженням амбулаторних навичок та прогресуванням захворювання [22].

4.2. Системне запалення та стан харчування при DMD

Цитокіни секретуються жировою тканиною, і ця секреція збільшується у людей, що страждають ожирінням. М'язи хлопців-дистрофіків замінюються жировою масою. Отже, запалення у хворих на ДМД також може бути наслідком ожиріння.

Ми спостерігали, що концентрація запальних молекул, шкала Вігноса та вік була однаковою серед груп з різним рівнем харчового статусу, що свідчить про подібний запальний статус незалежно від ступеня ожиріння. Наприклад, діти з низькою вагою та ожирінням мають подібні показники цитокінів. Цікаво, що наші результати свідчать про те, що у пацієнтів із недостатньою вагою системне запалення може бути частково спричинене патологією ДМД, оскільки ці пацієнти мають меншу жирову масу. Однак у пацієнтів із зайвою вагою або ожирінням це системне запалення може бути спричинене жировою тканиною. Повідомлялося, що прозапальні цитокіни підвищені у дітей із ожирінням. Автори повідомили про більш високу концентрацію сироваткового IL-6 (0,14 проти 0,05 пг/мл) та TNF-α (9,2 пг/мл проти 8,1) у мексиканських дітей з ожирінням (13 років), ніж у дітей, що не страждають на ожиріння [29].

Іншими молекулами, пов’язаними з ожирінням, є СРБ, адипонектин та лептин. Печінка та жирова тканина виробляють CRP, і обидва можуть сприяти підвищенню рівня CRP у плазмі при ожирінні. Велика кількість жиру в організмі може виробляти важливу частину циркулюючого СРБ [17, 30]. Як і очікувалось, у хлопчиків із надмірною вагою та ожирінням збільшився рівень СРБ та лептину через збільшення жиру в організмі. Ці дві молекули (СРБ і лептин) також були збільшені в групі шкали Віньйоса С, можливо, це пояснювалося тим, що у суб'єктів групи шкали С Виньоса були найвищі значення жирової маси [11].

Однак важливо врахувати, що це дослідження має деякі обмеження. Ми оцінювали ці цитокіни в крові, але не в м’язах. Однак слід враховувати, що це циркулюючі цитокіни, і це може запропонувати пояснення щодо запального стану м’язів. Іншим обмеженням є відсутність контрольних суб'єктів того ж віку для оцінки концентрації цитокінів. Основна сила цього дослідження полягає в тому, що ми вперше продемонстрували різницю в запальному статусі серед груп з різним рівнем м'язової функції та харчовим статусом. Оскільки запалення відіграє ключову роль у патологічному прогресі, необхідно оцінити інших учасників запального процесу під час дистрофії, таких як інші цитокіни та імунологічні клітини, щоб запропонувати різні процедури лікування у цих пацієнтів.

5. Висновки

Наскільки нам відомо, ці нові результати представляють докази щодо статусу запалення у хворих на ДМД з різним рівнем м’язової функції. У першому стані патології, коли пацієнти мають кращі м’язові функції, статус системного запалення підвищується. Це запалення зменшується у пацієнтів з гіршою функцією м’язів. Концентрація системних запальних молекул не залежить від харчового статусу.

Конфлікт інтересів

Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.

Подяка

Автори висловлюють свою вдячність пацієнтам та сім'ям за участь у дослідженні. Цю роботу підтримав Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, Мексика (грант № Salud-2012-180058). Автори відзначають Шерон Морі, Scientific Communications, за надання редакційної допомоги.