Розробка низькокалорійного цукру та функціональної їжі зизифусу з використанням технології біологічної трансформації та бродіння

Ян Мен

1 Національна інженерна лабораторія промислових ферментів, Тяньцзіньський інститут промислових біотехнологій, Китайська академія наук, Тяньцзінь, Китай,

Пінг Чжу

Юемін Чжу

Ян Цзень

Цзянган Ян

Юансія Сонце

Анотація

1. ВСТУП

Зизифус (Ziziphus jujuba Mill), колюча рослинна рослина, широко відомий як китайський зизифус або червона фініка. Плоди зизифусу містять багато харчових компонентів, таких як полісахариди, тритерпеноїди, флавоноїди, вітаміни, циклічний нуклеотид та фенольні сполуки (Du et al., 2013; Lee, Min, Lee, Kim, & Kho, 2003; Li, Fan, Ding, І Дін, 2007). Особливо, плоди зизифусу містять певну кількість циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ), який позитивно впливає на серцевий м’яз, харчовий міокард, діастолічні судини, антиаритмію та агрегацію тромбоцитів (Beavo & Brunton, 2002). Розробка функціональних продуктів харчування, багатих на цАМФ, має великий економічний потенціал та ринкову вартість. Зизифус також використовується як традиційна китайська медицина (ТКМ) протягом тисячоліть з його численними оздоровчими ефектами, такими як протизапальний (Yu et al., 2012), протипухлинний (Plastina et al., 2012), шлунково-кишкові захисні засоби (Huang, Yen, Sheu, & Chau, 2008), антиоксидант (Cheng, Zhu, Cao, & Jiang, 2012), анти-безсоння та нейропротекторні ефекти (Yoo et al., 2010).

Доведено, що технологія бродіння молочнокислих бактерій є ефективним способом збереження або поліпшення смаку, безпеки, харчування, якості та терміну придатності фруктів та овочів. Харчова цінність ферментованих харчових продуктів зростала через накопичення вільних амінокислот (FAA) у процесі бродіння. Як правило, деякі молочнокислі бактерії виробляють γ-аміномасляну кислоту (ГАМК), яка має нейромедіаційну, гіпотонічну, діуретичну та транквілізаторну дію (Wong, Bottiglieri, & Snead, 2003). Розробка збагачених ГАМК напоїв методом бродіння досягла успіху в соку чорної малини (Kim, Lee, Ji, Lee, & Hwang, 2009), молоці (Nejati та ін., 2013) та напої, подібному до темпе (Aoki, Furuya, Endo, & Fujimoto, 2003). Крім того, молочнокислі бактерії як пробіотики все частіше використовуються як харчові добавки. Пробіотичні продукти зазвичай продаються у формі ферментованих молочних продуктів, фруктових або овочевих соків (морквяний сік, томатний сік), які служать середовищем для росту клітин.

У цьому дослідженні ми намагаємось підвищити харчову цінність концентрованого/екстрагованого соку зизифусу, поєднуючи трансформацію ферментів та ферментацію молочнокислих бактерій. Порівнювали вміст глюкози та фруктози в різних видах зизифусу. Два ферменти, GI та DAE, поєднувались для перетворення глюкози та фруктози у низькокалорійну солодшу D-алюлулозу. Крім того, ферментацію соку зизифусу з використанням двох видів молочнокислих бактерій проводили для збільшення вмісту ГАМК та багатьох вільних амінокислот.

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

2.1. Ферменти, штами та матеріали

3-епімеразу D-аллулози (DAE) готували згідно з позаклітинним продукуванням за допомогою секретної експресійної системи (Chen et al., 2016). D-глюкоза-ізомераза (GI) була придбана у Novozymes ®, Ltd, Китай. Активність DAE досягала 31,0 Од/мл, а GI становив 400 IGIU/г. Молочнокислі бактерії, такі як Pediococcus pentosaceus PC ‐ 5, Lactobacillus plantarum M, Lactobacillus rhamnosus та Lactobacillus acidophilus, зберігались у нашій лабораторії. П’ять видів плодів зизифусу, використані в цій роботі, були зібрані з вересня по жовтень 2016 року в місті Тайюань провінції Шаньсі, Китай.

2.2. Аналіз вмісту цукру в п’яти плодах зизифуса

Зизифусову зизифусу зазвичай називають зизифусом або китайською фінікою. У цьому дослідженні восени були зібрані плоди зизифусу з п’яти сортів (Changhong, J-CH; Dongzao, J-DZ; Jinsi, J-JS; Pozao, J-PZ; та Yuanling, J-YL). Всі зразки зизифусу нарізали, кип'ятили у воді протягом 3 годин, а потім залишок видаляли для отримання концентрованого соку. Вміст глюкози, фруктози та сахарози аналізували за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), оснащеної детектором показника заломлення та однією колонкою Sugar-Pak ™ (6,5 мм × 300 мм; води). Загальний полісахарид визначали за допомогою колориметричного методу фенол-сірчана кислота (Cheung et al., 2009). Відновлення цукру було виявлено методом DNS (Cheung et al., 2009).

2.3. Ферментативна конверсія моносахариду в соку зизифуса

Ферментативну трансформацію, що каталізується GI та DAE, проводили при 55 ° C у концентрованому соку зизифуса, рН якого регулювали до 6,0, використовуючи 1 M NaHCO3. Після реакції протягом 4 годин зразки аналізували за допомогою ВЕРХ для розрахунку концентрації D-алюлози. Досліджено вплив температури (від 50 до 65 ° C), рН (від 4,0 до 8,0) та кількості ферменту (від 0,5 до 2,0 г/л) на конверсію D-алюлози.

2.4. Ферментація соку зизифусу з використанням молочнокислих бактерій

Pediococcus pentosaceus PC ‐ 5 та L. plantarum M були обрані для оцінки їх росту клітин, вироблення кислоти та вмісту загальних поліфенольних та загальних флавоноїдів. Вибрані закваски попередньо культивували в середовищі MRS при температурі 37 ° C протягом 24 годин до приблизно 10 8

10 9 у.е./мл. Потім клітини інокулювали в концентрований сік зизифусу з шестикратним розведенням у колбах по 500 мл. Потім процес ферментації проводили при 37 ° С протягом 24 годин. Зразки збирали для ВЕРХ та аналізу росту клітин. Життєздатні клітини (cf/u/мл) визначали стандартним методом підрахунку пластин.

2.5. Аналіз харчових інгредієнтів

Концентрації органічних кислот (молочної та оцтової кислот) визначали кількісно за допомогою ВЕРХ, використовуючи колонку Aminex HPX ‐ 87H (вилучення іонів, BioRad) з УФ-детектором, що працює при 210 нм. Використовували рухливу фазу 10 мМ розчину H2SO4 зі швидкістю потоку 0,6 мл/хв, і колонку працювали при 60 ° C.

FAA та γ-аміномасляну кислоту (GABA) визначали за допомогою ВЕРХ, використовуючи ZORBA Eclipse-AAA (4,6 мм × 150 мм; Agilent) з УФ-детектором, що працює при 338 нм. Рухомими фазами були A (фаза рівноваги): дигідрофосфат натрію (40 мМ) і B (фаза елюції): ацетонітрил: метанол: вода (45:45:10). В якості похідного реагенту використовували боратний буфер. Швидкість потоку становила 2 мл/хв при 40 ° С.

Концентрацію цАМФ також вимірювали за допомогою ВЕРХ, використовуючи реверсивно-фазову колонку Ultimate C18 (21,2 мм × 250 мм, частинки 5 мкм, Уелч, Шанхай, Китай) з УФ-детектором, що працює при 254 нм. Рухлива фаза дигідрофосфату калію (20 мМ): розчин метанолу = 80:20 використовували при 0,8 мл/хв, а колонка працювала при 40 ° C.

Іони металів визначали за допомогою атомно-абсорбційного спектрофотометра (Spectra-AA220, Varian Co., Пало-Альто, Каліфорнія, США) після перетравлення в змішаних кислотах (азотна кислота: хлорна кислота = 4: 1). Вміст фосфору визначали методом молібденового синього на довжині хвилі 660 нм (Wei, Chen, & Xu, 2009).

Загальний вміст фенолів у соку зизифусу визначали згідно з колориметричним методом Фоліна – Чіокальтеу (Tawaha, Alali, Gharaibeh, Mohammad, & El ‐ Elimat, 2007). Зразок 0,2 мл змішували з 0,2 мл реагенту Фолін-Ціокальтеу при кімнатній температурі протягом 3 хв. Потім до суміші додавали 0,4 мл 10% Na2CO3. Після стояння протягом 60 хв поглинання вимірювали спектрофотометром при 725 нм.

Вміст загальних флавоноїдів вимірювали за методом NaNO2 – AlCl3 – NaOH (Fu, Xu, Zhao & Ma, 2006). Коротко, 30 мкл розведеного зразка (1: 2) у метанолі змішували з 9 мкл NaNO2 (5%). Після реакції протягом 6 хв додавали 18 мкл AlCl3 (10%). Подальша реакція протягом 5 хв до суміші додавали 60 мкл NaOH (1 М). Об'єм суміші доводили до 300 мкл дистильованою водою, а потім вимірювали при 510 нм. Для розрахунку стандартної кривої використовували різні концентрації рутину (0,1–500 мг/л).

3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

3.1. Аналіз вмісту цукру

Було відомо, що зизифус містить високу концентрацію цукру; однак вміст цукру має очевидну різницю серед сортів (Li et al., 2007). Тут ми порівняли із вмістом загального цукру сахарози, що відновлює цукор у соку зизифусу п’яти різних сортів (J-CH, J-DZ, J-JS, J-PZ, J-YL), які широко поширені в Китаї. . Вміст сахарози в п’яти сортах становив 1). Зокрема, вміст глюкози та фруктози в J-JS досягав 23% та 28% відповідно. Вміст сахарози був нижчим, ніж вміст фруктози та глюкози в J-JS. Порівняно високий вміст фруктози та глюкози в соку зизифусу J-JS зробив його сприятливою субстратною основою для ферментативного синтезу D-алюлози на пізній стадії.