Рецептор NLRP3 сприяє захисту від експериментального антиген-опосередкованого холангіту

  • Розділений екран
  • Перегляд значок Перегляди
    • Зміст статті
    • Цифри та таблиці
    • Відео
    • Аудіо
    • Додаткові дані

  • Посилання PDF PDF
  • Поділитися піктограмою Поділіться
    • Facebook
    • Twitter
    • LinkedIn
    • Електронна пошта

  • Марісоль Ібет Гонсалес, Даніель Ваннан, Бертус Екстін, Хосе Луїс Рейєс; Рецептор NLRP3 сприяє захисту від експериментального антиген-опосередкованого холангіту. Biosci Rep 28 серпня 2020 р .; 40 (8): BSR20200689. doi: https://doi.org/10.1042/BSR20200689

    антиген-опосередкованого

    Завантажити файл цитування:

    Анотація

    Вступ

    Тут ми описуємо, що NLRP3 необхідний для обмеження імунопатогії, що спостерігається при експериментальному антиген-специфічному жовчному запальному захворюванні. У мишей, у яких відсутня запальна форма NLRP3, спостерігалося більш серйозне руйнування жовчних проток, яке посилювалось, коли мишей піддавали обезогенній дієті.

    Матеріали і методи

    Індукція мишей та холангіту

    Ми змоделювали гострий холангіт, використовуючи трохи модифікований протокол із моделі OVAbil [15], як повідомлялося раніше [16]. Експерименти на тваринах проводились в Інституті хронічних хвороб Снайдера (Університет Калгарі), а протокол дослідження M11025 був затверджений Комітетом з догляду за тваринами Університету Калгарі та відповідав Рекомендаціям по догляду та використанню лабораторних тварин. Коротко кажучи, мишей C57BL/6, що експресують фрагмент 139-285aa мембранно-зв’язаного білка овальбуміну (OVAbil), використовували як тварин-реципієнтів та порівнювали з мишами, які відповідали віку та статі, яким не було датчика NLRP3 (OVAbilxNLRP3 -/-). Обидві групи годувались або стандартною чау (SC), або дієтою з високим вмістом жиру (HFD) протягом 12 тижнів, як описано раніше [16]. Миші, що годували SC та HFD, отримували 1 × 10 7 лімфоцитів селезінки, отримані від OVA-трансгенних мишей I та II (OTI та OTII), шляхом інтраперитонеальних (ip.) Ін’єкцій.

    Гістологія

    Через десять днів після перенесення клітин OTI та OTII (індукція холангіту) мишей по-людськи вбивали під глибокою інгаляційною анестезією (ізофлуран) з подальшим вивихом шийки матки та збиранням зразків печінки. Тканину вкладали у парафін та розділяли (товщиною 5 мкМ) перед фарбуванням H&E для гістопатологічного аналізу. Під світловим мікроскопом для архітектури жовчних проток було оцінено 5 випадкових портальних шляхів, обраних випадковим чином: 0; жовчний проток добре збережений, 1; невпорядкований жовчний проток 2; інфільтруючі клітини, що витісняють холангіоцити, 3; жовчна протока відсутня. Для оцінки запалення 0; відсутні інфільтруючі клітини, 1; помірні інфільтруючі клітини, 2; масивні запальні клітини лише в портальних шляхах 3; масивні запальні клітини, включаючи паренхіму печінки.

    Проточна цитометрія

    Після жертвоприношення печінку експериментальних груп отримували та гомогенізували у FBS, що містить PBS, за допомогою тканинного дисоціатора softMACS (Miltenyi Biotec Inc, Німеччина). Зразки шарували на 33/77% градієнтів перколлу (Percoll, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Уппсала, Швеція) і центрифугували протягом 20 хв при 200 g, при кімнатній температурі для досягнення поділу клітин. Суспензії клітин, вилучені з градієнтів, регулювали (1 × 10 6/мл) і фарбували в проточному цитометричному буфері (5% FBS, 5 мМ EDTA та 0,1% азиду натрію). Фарбування проводили з використанням таких кон'югованих фторхромом антитіл: PO-CD11b, PECy7-F4/80, APC-Cy7-Ly6C та PE-Ly6G. Дані отримували на проточному цитометрі Aria II (BD Biosciences) та аналізували за допомогою програмного забезпечення Kaluza (Beckman Coulter, США).

    Тести на сироватку крові

    Цільну кров відбирали шляхом серцевої пункції у мишей під глибокою анестезією при жертвоприношенні (ізофлуран, продукти, що містять галоген). Зразки крові центрифугували, а сироватки з експериментальних груп тестували на рівень аланінамінотрансферази (ALT) лабораторіями Calgary Laboratory (Калгарі, АБ, Канада) та розчинними імунними медіаторами з аналізом мишачого цитокіну 31-plex Discovery Assay (Eve Technologies, Calgary, AB, Канада), як повідомляється [16]. Концентрації цитокінів та хемокінів показані у пг/мл.

    Презентація даних

    Усі результати представлені як середнє значення ± стандартна помилка середнього значення (SEM). Дані аналізували в програмі Graph pad призми 6.0 одним способом ANOVA з подальшим кількома порівняннями, де P -/- миші порівняно з OVAbil (393 ± 51 проти 224 ± 49, відповідно, див. Малюнок 1A). Гістопатологічний аналіз показав помірний ступінь інфільтрації імунних клітин у мишей SC OVAbil на 10-й день після перенесення OVA-Tcells з видимими жовчними протоками в портальні тракти (Фігура 1B, C). На противагу цьому, OVAbilxNLRP3 -/- мав більш широкі запальні вогнища на портальних трактах та втрату ідентифікованих жовчних проток (рис. 1B, C). Потім ми вирішили перевірити гіпотезу, згідно з якою відсутність запальної інфекції NLRP3 може селективно впливати на нашу модель OVAbil, оскільки раніше повідомлялося, що NLRP3 бере участь у розвитку ожиріння та стеатозі печінки [17]. Відповідно до наших попередніх висновків [16], миші OVAbil, які годувались обесогенною дієтою, мали підвищені інфільтруючі імунні клітини, націлені на холангіоцити, що призводило до відсутності жовчних проток (рис. 1D). Цікаво, що у мишей OVAbilxNLRP3 -/- спостерігався подібний стеатоз, як у мишей OVAbil, однак спостерігалася більша площа перипортальних та частіших паренхіматозних запальних вогнищ (рис. 1D).

    Наявність NLRP3 запобігає втраті жовчних проток

    Раніше ми повідомляли, що тяжкість нашої моделі холангіту пов'язана з інфільтрацією нейтрофілів та зменшенням кількості моноцитів [16]. Тут ми підтвердили, що перебільшена гістологічна травма, яка сталася за відсутності NLRP3 у мишей OVAbil, супроводжувалась масовим набором нейтрофілів (Малюнок 2А). Відповідно до цього, миші з ожирінням OVAbilxNLRP3 -/- продемонстрували ще більш різке збільшення кількості нейтрофілів (малюнок 2А, нижня панель). Коли розподіл Ly6C hi та Ly6 lo макрофагів також визначали в популяції мієлоїдів (CD11b +), ми спостерігали меншу кількість субпопуляції Ly6C hi макрофагів у мишей, у яких не було NLRP3, незалежно від використовуваної дієти (рис. 2B). Таким чином, у мишей OVAbil, у яких не було NLRP3, загострилася кількість нейтрофілів, що корелювало з неконтрольованим відгуком, націленим на холангіоцити.

    Масивна інфільтрація нейтрофілів корелює з важким ураженням жовчних шляхів

    Дієтозалежний профіль медіаторів запалення призводить до запалення жовчі

    Медіатори, асоційовані з типом 2, у зразках сироватки

    Обговорення

    Аналіз профілю цитокінів показав, що важкий фенотип, який виявляється у мишей, у яких відсутній NLRP3, є результатом різних комбінацій медіаторів запалення у СК порівняно з мишами, яких годували HFD. У мишей, що харчуються SC, абсцесія NLRP3 призводить до надмірної експресії IL-6 та CXCL10, обох вроджених медіаторів запалення. Показано, що одним із ефектів NLRP3-опосередкованої секреції IL-1β є індукція IL-6 і С-реактивного білка [20], таким чином, очікується, що канонічний шлях активації NLRP3 буде індукувати більше IL-6, що дивно, але в наших руках миші, у яких відсутній NLRP3, продукували порівняно низькі кількості IL-1β, як у мишей, достатніх для NLRP3 (рис. 3), але посилений IL-6, що припускає, що в цій моделі існує незалежний від NLRP3 вивільнення IL-6 або відбувається альтернативна неканонічна активація NLRP3.

    З іншого боку, ми раніше повідомляли, що миші з ожирінням виявляють важкий холангіт, пов’язаний із комбінованим профілем IL-13/IL-15/IL-17, і справді нейтралізація IL-15 послаблювала хворобу. Що цікаво, миші з ожирінням з дефіцитом NLRP3, група з руйнівним запаленням печінки, не виявляли збільшення IL-15 і фактично придушували IL-17, але комбінований профіль IL-13/TNFα був пов’язаний з цією переважною хворобою. Це свідчить про те, що IL-13 може набути високопатогенної ролі в поєднанні з іншими запальними цитокінами. Що цікаво, спостерігалося селективне збільшення IL-13 серед факторів 2 типу, що свідчить про те, що клітинне джерело IL-4 та IL-13 може не бути спільним.

    Роль NLRP3 у стимулюванні реакцій Th-17 у шлунково-кишковому тракті потребує уточнення, оскільки Tian et al. повідомили, що активація NLRP3 сприяє виробленню IL-17 при аутоімунному холестазі, породженому домінуючою негативною ізоформою рецептора TGFβ II (TGFβRII) [21]. Відповідно до цього Арсенієвич та співавт. нещодавно описано центральну роль NLRP3 у рушії IL-17 в інфекційній моделі холангіту [22]. На відміну від цього, миші з дефіцитом NLRP3, індуковані колітом, вивільняли більше IL-17 [9]. Таким чином, у нашій імунно-опосередкованій моделі (OVAbil) відсутність NLRP3 спричинила незалежне від IL-17 загострення захворювання.

    Таким чином, дефіцит NLRP3 у мишей OVAbil призводить до неконтрольованого перебігу захворювання при індукції специфічної для холангіоцитів імунної відповіді. Потрібні подальші дослідження для з’ясування цієї складної мережі імунних клітин та медіаторів запалення.

    Конкуруючі інтереси

    Автори заявляють, що з рукописом немає жодних суперечливих інтересів.

    Фінансування

    Ця робота була підтримана грантами Канадського Інституту досліджень охорони здоров’я (CIHR) Ініціативна група підписів Грант з питань охорони здоров’я при хронічному запаленні для B.E. та Програма de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (proyecto IA204618) для J.LR.

    Внесок автора

    J.L.R. та B.E. задумав і спланував експерименти. M.I.G., J.L.R. та D.T.R. проводили досліди. D.T.R., B.E. та J.L.R провели інтерпретацію результатів та написали рукопис.

    Подяки

    Ми хотіли б подякувати доктору Даніелю Муруве (Університет Калгарі) за надання мишей з дефіцитом NLRP3.