Профілактика та лікування ожиріння, резистентності до інсуліну та діабету смолою, що зв’язує жовчні кислоти

Анотація

Діабет 2 типу та дисліпідемія є загальними порушеннями обміну речовин, і їх поширеність у всьому світі стикається з різким зростанням, включаючи передбачувану епідемію діабету, при цьому кількість хворих на цукровий діабет збільшиться більш ніж удвічі, досягнувши до 20 мільйонів до 2025 року. Діабет 2 типу та дисліпідемія частіше пов’язані між собою, ніж випадково, що вказує на можливий загальний механізм (-и), що лежить в основі їхньої етіології (2). З клінічної точки зору, дисліпідемія у хворих на цукровий діабет 2 типу має кілька особливостей: переважання залишкових частинок та невеликих щільних ЛПНЩ та підвищення рівня тригліцеридів у плазмі крові, особливо в постпрандіальному стані, а також низький рівень холестерину ЛПВЩ (3). Вони є високоатерогенними і, таким чином, схильні пацієнтів з діабетом до атеросклеротичної хвороби, наприклад, до ішемічної хвороби серця та інсульту, що не тільки становить 70% смертності хворих на цукровий діабет, але й створює соціальне та економічне навантаження в багатьох країнах ( 2–7). Отже, терапевтичні стратегії, які є корисними для обох станів, настійно виправдані.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Аналітичні процедури визначення фенотипу.

Гістологічне дослідження печінки та підшлункової залози.

Заморожені зрізи печінки, пофарбовані Суданом III, досліджували за допомогою флуоресцентного мікроскопа з програмним забезпеченням для аналізу зображень, програмним забезпеченням IPLab Spectrum (Scanalytics), а ділянку, забарвлену Суданом III, визначали кількісно в чотирьох полях з кожного зразка. Парафінові зрізи підшлункової залози фарбували гематоксилін-еозином за стандартною методикою. Масу острівців кількісно визначали у восьми острівцях від кожного зразка BZ-Analyzer (Keyence, Осака, Японія).

Вимірювання концентрації жовчної кислоти та ліпідів у калі.

Фекалії збирали протягом 48 годин протягом 3-5 днів дієтичного харчування, що містить жир або колестимід, у мишей NSY у віці 20 тижнів (n = 6 мишей на групу). Кал висушували та подрібнювали в порошок, а фекальні жовчні кислоти екстрагували з порошкоподібних фекалій 100 мг з 90% етанолом згідно методу Tokunaga et al. (21); витягнуті розчини використовувались для ферментативного визначення концентрації жовчних кислот за допомогою набору загальних жовчних кислот (Wako, Osaka, Japan). Загальний обсяг ліпідів екстрагували з 500 мг порошкоподібних фекалій хлороформом/метанолом (2: 1 об./Об.) Згідно з методом Folch et al. (22). Вилучені загальні ліпідні речовини в калі визначали гравіметрично.

Підготовка РНК та аналіз рівня експресії.

Статистичний аналіз.

Усі результати виражаються як середні значення ± SE. Фенотипові дані були статистично проаналізовані або за допомогою критерію t Стьюдента, або одностороннього ANOVA з пост-hoc аналізом за допомогою F-тесту Шеффе. Відмінності з P −1 · день −1; P −1 · день -1), що свідчить про те, що зменшення маси тіла при лікуванні колестимідом не було обумовлено зменшенням споживання їжі. Дієта, що містить колестимід, добре переносилась, і явного побічного ефекту не спостерігалося. Єдиними очевидними фенотиповими змінами, що спостерігались, були профілактика ожиріння, збільшення споживання їжі та збільшення кількості калу.

Концентрація холестерину та тригліцеридів у сироватці крові покращується завдяки смолі, що зв’язує жовчні кислоти.

У дослідженні профілактики концентрація загального, ЛПНЩ та холестерину ЛПНЩ у сироватці крові була значно нижчою у мишей, які отримували колестимід, ніж у тих, хто не мав віку 15 тижнів (рис. 2). У дослідженні втручання рівень холестерину ЛПНЩ показав значне зниження, а загальний і холестерин ЛПНЩ продемонстрували тенденцію до зменшення кількості мишей з колестимідом порівняно з тими, хто не отримував лікування після 5 тижнів (рис. 2А). Холестерин ЛПВЩ не відрізнявся серед груп. Концентрація тригліцеридів у сироватці крові, тригліцеридів ЛПНЩ та тригліцеридів ЛПНЩ у групі профілактики була значно нижчою, ніж у контрольній групі (рис. 2Б). Група втручання показала тенденцію до зниження загального рівня тригліцеридів та тригліцеридів ЛПНЩЩ порівняно з контрольною групою (рис. 2Б).

Жирна печінка та накопичення жиру покращуються смолою, що зв’язує жовчні кислоти.

Вага печінки суттєво зменшилась при лікуванні колестимідом як у групах профілактики, так і в групах втручання (Таблиця 1). Гістологічний аналіз печінки показав значне зменшення забрудненої зоною Судану III у групах профілактики (зниження 69%) та втручання (зниження 41%) порівняно з контрольною групою, вказуючи на помітне поліпшення жирової функції печінки лікуванням колестимідом (таблиця 1 та Інтернет-додаток Рис. 1 [доступний на http://diabetes.diabetesjournals.org]).

У групі профілактики вага підшкірного жиру значно зменшився, а група втручання продемонструвала тенденцію до зменшення. Вага вісцерального жиру (заочеревинний, мезентеріальний та епідидимальний жир) та вага БАТ не суттєво відрізнялися серед трьох груп (табл. 1). При гістологічному дослідженні адипоцитів з вісцерального жиру та НДТ розмір клітин та накопичення крапель ліпідів суттєво не відрізнялися серед груп (Інтернет-додаток, рис. 3).

Інсулінорезистентність та порушення секреції інсуліну покращуються смолою, що зв’язує жовчні кислоти.

У віці 20 тижнів у контрольних мишей спостерігалася виражена гіперглікемія, але це помітно і суттєво послаблювалось лікуванням колестимідом як у групах профілактики, так і в терапії (табл. 1). Рівень інсуліну в сироватці натще був помітно вищим у контрольній групі, що свідчить про резистентність до інсуліну у цій групі (рис. 3А). Введення колестиміду суттєво послаблює гіперінсулінемію як у групах профілактики, так і втручання (рис. 3А). Для подальшого підтвердження впливу колестиміду на резистентність до інсуліну було проведено тест на толерантність до інсуліну. Понижуючий глюкозу ефект інсуліну був помітно порушений у контрольній групі, що підтвердило виражену резистентність до інсуліну в цій групі (рис. 3B). Знижуючий глюкозу ефект інсуліну помітно покращився лікуванням колестимідом як у профілактичній, так і в групі втручання (рис. 3B), вказуючи на те, що чутливість до інсуліну покращувалась колестимідом. Щоб дослідити можливий внесок адипонектину у покращення чутливості до інсуліну, вимірювали концентрацію адипонектину в плазмі. Концентрація адипонектину в плазмі не суттєво відрізнялася серед трьох груп (табл. 1).

Для подальшого з’ясування впливу колестиміду на метаболізм глюкози та секрецію інсуліну проводили пероральний тест на толерантність до глюкози. Рівень глюкози в крові через 120 хв після перорального прийому глюкози був значно нижчим у профілактичній групі, ніж у контрольній групі (рис. 3С); що в групі втручання продемонструвало тенденцію до зменшення і було проміжним між показником у групах профілактики та контролю. Реакція інсуліну на глюкозу була повністю скасована у контрольній групі, що свідчить про помітно порушену реакцію інсуліну на глюкозу у цій групі (рис. 3D). Відповідь інсуліну на глюкозу покращили лікуванням колестимідом як у профілактичній, так і в групі втручання (рис. 3D). У сукупності ці дані вказують на те, що як резистентність до інсуліну, так і порушення секреції інсуліну покращувались лікуванням колестимідом (таблиця 1 та рис. 3). Гістологічне дослідження острівців підшлункової залози показало, що збільшена площа острівців у контрольній групі була значно зменшена при лікуванні колестимідом у групі профілактики (зменшення на 39%) (таблиця 1). Площа острівця в групі втручання суттєво не відрізнялася від площі в групі контролю.

Виведення ліпідів з калом збільшується завдяки смолі, що зв’язує жовчні кислоти.

Зменшення приросту маси тіла без зменшення споживання їжі у мишей, які отримували колестимід, припускає можливість того, що колестимід може мати знижене енергопоглинання, зокрема, абсорбцію ліпідів. Щоб вивчити цю можливість, ми виміряли фекальну екскрецію жовчних кислот та ліпідів. Виведення фекалією жовчних кислот збільшилось у ~ 3,5 рази за допомогою лікування колестимідом, що вказує на те, що колестимід успішно потрапляв у організм мишей і здійснював свій біологічний ефект як смола, що зв'язує жовчні кислоти (рис. 4А). Екскреція ліпідів з фекаліями збільшилася приблизно у сім разів у мишей із застосуванням колестиміду (рис. 4В), що вказує на те, що колестимід помітно знижував всмоктування ліпідів з кишечника.

Експресія генів, пов’язаних з метаболізмом ліпідів та глюкози в печінці.

Для з’ясування молекулярних механізмів, що лежать в основі метаболічних змін при лікуванні колестимідом, досліджували профілі експресії генів, пов’язаних з метаболізмом ліпідів та глюкози в печінці. Як і очікувалось, рівень мРНК CYP7A1, обмежуючий швидкість ферменту катаболічного шляху холестерину, був збільшений приблизно у чотири рази у мишей із застосуванням колестиміду порівняно з тими, що не мали (рис. 5). Рівень мРНК SHP, репресора для транскрипції CYP7A1, був значно знижений у мишей із застосуванням колестиміду. Рівень мРНК FXR, ядерного рецептора жовчних кислот і регулятора SHP, суттєво не відрізнявся серед трьох груп. Рівень мРНК SREBP-1c, головного регулятора ліпогенних генів, був знижений у мишей з колестимідом порівняно з тими, хто не мав. Зміни у вираженні SREBP-1c були паралельними змінам у вираженні SHP.

Для уточнення механізму застосування колестиміду у покращенні жирності печінки та ліпідного профілю сироватки досліджували рівні експресії генів, що беруть участь у біосинтезі та β-окисленні жирних кислот. Рівень мРНК FAS, ключового ферменту синтезу жирних кислот, а також відомого як мішень для SREBP-1c, був значно знижений у групі профілактики та мав тенденцію до зниження в групі втручання (рис. 5). Експресія CPT-1, ключового ферменту β-окислення жирних кислот, суттєво не відрізнялася серед трьох груп. Рівень експресії PEPCK, ключового ферменту глюконеогенезу, був значно нижчим у групі профілактики, ніж у групі контролю (рис. 5). Рівень експресії PEPCK у групі втручання показав тенденцію до зниження та проміжне значення між рівнем у групах профілактики та контролю.

ОБГОВОРЕННЯ

Лікування колестимідом зменшує накопичення ліпідів у печінці та підшкірному жирі, але не у вісцеральному жирі. Дієта з високим вмістом жиру значно збільшила підшкірний жир (2,52 ± 0,24 проти 4,24 ± 0,23 г для стандартної дієти проти дієти з високим вмістом жиру, відповідно), але не вісцеральний жир (3,06 ± 0,19 проти 2,82 ± 0,07 г, відповідно), що вказує що введення колестиміду зменшувало накопичення жиру в органах, уражених дієтою з високим вмістом жиру, тобто в печінці та підшкірному жирі. Ці дані, разом із суттєвими змінами рівня адипонектину в плазмі внаслідок лікування, свідчать про те, що інші фактори, крім маси вісцерального жиру, відігравали роль у поліпшенні ожиріння та резистентності до інсуліну колестимідом, принаймні, на моделі миші, використовуваній у цьому дослідженні. Помітне поліпшення жирності печінки, яке спостерігалося в цьому дослідженні, може бути відповідальним за це. Накопичувальні докази як на тваринних моделях (23,24), так і на людях (25,26) свідчать про тісний зв'язок жирової печінки з резистентністю до інсуліну та діабетом. Повідомлялося, що зменшення накопичення ліпідів у печінці зменшує печінкову резистентність до інсуліну та нормалізує глюконеогенез у хворих на цукровий діабет 2 типу без зміни периферичного метаболізму глюкози (25).

Незважаючи на сприятливий вплив жовчних кислот (таких як холева кислота та хенодезоксихолева кислота) на глюкозу, ліпіди та енергетичний обмін (29, 30, 33), використання жовчних кислот у людей обмежене через токсичні побічні ефекти, особливо в печінки та збільшення рівня холестерину ЛПНЩ за рахунок пригнічення активності рецепторів ЛПНЩ (37). Сприятливий ефект смол, що зв’язують жовчні кислоти, як це спостерігається у цьому дослідженні, а також їх добре встановлена безпека та ефективність при лікуванні гіперхолестеринемії у людей вказують на можливе використання цього виду препаратів для лікування не тільки гіперхолестеринемії, але також ожиріння, резистентність до інсуліну та діабет. Необхідні рандомізовані контрольовані клінічні випробування для з'ясування ефективності та безпеки цього препарату щодо глюкози, ліпідів та енергетичного обміну у людей.

На закінчення, це дослідження показало, що колестимід, смола, що зв’язує жовчні кислоти, покращує не тільки дисліпідемію, але також ожиріння, резистентність до інсуліну та діабет 2 типу, пригнічуючи SHP, плейотропний регулятор метаболічних шляхів. Ці дані свідчать про тісний зв’язок між метаболізмом жовчних кислот та метаболізмом глюкози, можливо через SHP, і вказують на нову терапевтичну мішень для лікування ожиріння, інсулінорезистентності та діабету 2 типу. Подальші дослідження щодо передачі сигналів про інсулін та втрати або посилення функції SHP в чутливих до інсуліну тканинах, а також дослідження на інших моделях тварин дадуть додаткове уявлення про механізми, за допомогою яких колестимід покращує резистентність до інсуліну та діабет. З огляду на добре встановлену ефективність та безпеку смол, що зв’язують жовчні кислоти, при лікуванні гіперхолестеринемії у людей, клінічні дослідження ефективності та безпеки цього виду препаратів при лікуванні ожиріння, інсулінорезистентності та діабету є виправданими.