Підготовка зразка вестерн-блот

Пов’язані

Препарати зразків вестерн-блот, включаючи буфери для лізису, лізат із культури клітин, лізат із тканин та визначення концентрації білка.

Зразок протоколу підготовки змісту

Буфери для лізису
Інгібітори протеази та фосфатази
Приготування лізату з клітинної культури
Приготування лізату з тканин
Визначення концентрації білка
Підготовка зразків до завантаження в гелі: денатуровані та нативні, зменшені та нередуковані

Буфери для лізису

Лізисні буфери відрізняються своєю здатністю солюбілізувати білки, при цьому ті, що містять додецилсульфат натрію (SDS) та інші іонні миючі засоби, вважаються найжорсткішими, а отже, найімовірніше, дають найвищий урожай.

Головним фактором при виборі буфера для лізису є розпізнавання обраного антитіла денатурованими зразками. Коли це не так, це буде зазначено в таблиці даних щодо антитіл, і слід використовувати буфери без миючого засобу або з відносно м’якими неіонними миючими засобами (NP-40, Triton X-100).
U

Розташування білка та вибір буфера лізису

Розташування білка	Рекомендований буфер
Ціла клітина	НП-40
Цитоплазматичний (розчинний)	Трис-HCl
Цитоплазматичний (пов'язаний з цитоскелетом)	Тріс-Тритон
Зв'язані мембраною	NP-40 або RIPA
Ядерна	RIPA або використовувати протокол ядерної фракції *
Мітохондрії	RIPA або використовувати протокол фракції мітохондрій *

* Білки, які знаходяться виключно або переважно в субклітинному місці, будуть більше збагачені лізатом субклітинної фракції порівняно з лізатами цілих клітин або тканин. Це може бути корисно при спробі отримати сигнал для слабо вираженого білка. Будь ласка, зверніться до наших окремих протоколів щодо фракціонування субклітин.
U

Рецепти буфера лізису:

150 мМ хлориду натрію
1,0% NP-40 (Triton X-100 можна замінити NP-40)
50 мМ Трис рН 8,0

Це популярний буфер для вивчення білків, які пов'язані з цитоплазмою або мембраною, або для екстрактів цілих клітин. Якщо існує занепокоєння з приводу того, що цікавий білок витягується не повністю з нерозчинного матеріалу або агрегатів, буфер RIPA може бути більш придатним, оскільки він містить іонні миючі засоби, які легше приведуть білки до розчину.

Буфер RIPA (буфер аналізу радіоімунопреципітації)

150 мМ хлориду натрію
1,0% NP-40 або Triton X-100
0,5% дезоксихолату натрію *
0,1% SDS (додецилсульфат натрію)
50 мМ Трис, рН 8,0

* Можна приготувати у вигляді 10% -ного вихідного розчину, який повинен бути захищений від світла.

RIPA-буфер корисний для екстрактів цілих клітин та мембранно-зв'язаних білків, і може бути кращим, ніж буфери NP-40 або Triton X-100, для вилучення ядерних білків. Це порушить взаємодію між білками та білками, і, отже, може бути проблематичним для імунопреципітацій та аналізів на випадок.

У випадках, коли важливо зберегти білково-білкові взаємодії або мінімізувати денатурацію, слід використовувати буфер без іонних миючих засобів (наприклад, SDS), а в ідеалі - без неіонних миючих засобів (наприклад, Triton X-100).

Лізис клітин безмиючим буфером досягається механічним зсувом, часто за допомогою гомогенізатора Даунсе або пропусканням клітин через наконечник шприца. У цих випадках достатньо простого буфера Тріс, але, як зазначено вище, буфери з миючими засобами необхідні для вивільнення білків, пов’язаних з мембраною або цитоскелетом.

Трис-Тритоновий буфер (білки цитоскелета)

10 мМ Трис, рН 7,4
100 мМ NaCl
1 мМ ЕДТА
1 мМ EGTA
1% Тритон Х-100
10% гліцерин
0,1% SDS
0,5% дезоксихолату

Всі ці чотири буфери зберігатимуть при 4 ° C протягом декількох тижнів або до року, якщо розділити їх на аликвоти та зберігати при -20 ° C.

Інгібітори протеази та фосфатази

Як тільки відбувається лізис, починається протеоліз, дефосфорилювання та денатурація. Ці події можна значно уповільнити, якщо зразки постійно зберігаються на льоду або при температурі 4 ° C, а відповідні інгібітори додаються свіжими до буфера лізису.

Готові до використання коктейлі з інгібіторів від різних постачальників, але ви можете приготувати свій коктейль самостійно.

Інгібітор	Протеаза / фосфатаза загальмований	Кінцева концентрація в буфері для лізису	Запас (зберігати при -20 ° C)
Апротинін	Трипсин, хімотрипсин, плазмін	2 мкг/мл	Розвести у воді, 10 мг/мл. Не використовуйте повторно розморожені аліквоти.
Лейпептин	Лізосомальна	5–10 мкг/мл	Розвести у воді. Не використовуйте повторно розморожені аліквоти.
Пепстатин А	Аспарагінові протеази	1 мкг/мл	Розвести в метанолі, 1 мМ.
PMSF	Серин, протеїнази цистеїну	1 мМ	Розвести в етанолі. Ви можете повторно використовувати ту ж аликвоту.
ЕДТА	Металопротеази, яким потрібні Mg 2+ та Mn 2+	5 мМ	Розведіть у dH20, 0,5 М. Доведіть pH до 8,0.
EGTA	Металопротеази, які потребують Ca 2+	1 мМ	Розведіть у dH20, 0,5 М. Доведіть pH до 8,0
Фторид натрію	Серин/треонін фосфатази	5–10 мМ	Розвести у воді. Не використовуйте повторно після розморожування.
Натрію ортованадат	Тирозин фосфатази	1 мМ	Розвести у воді. Не використовуйте повторно після розморожування.

Препарат ортованадата натрію

Виконайте всі дії в витяжній шафі.

Приготуйте 100 мМ розчин у подвійній дистильованій воді.
Встановіть рН 9,0 за допомогою HCl.
Варити до безбарвного кольору. Мінімізуйте зміну обсягу через випаровування, нещільно покриваючи.
Остудити до кімнатної температури.
Знову встановіть pH на 9,0.
Варити до безбарвного кольору.
Повторюйте цей цикл, поки розчин після кип'ятіння та охолодження не залишиться при рН 9,0.
Доведіть водою до початкового об'єму.
Зберігати в аліквотах при -20 ° C. Викиньте, якщо зразки пожовкли.
U

Приготування лізату з клітинної культури

Помістіть посуд для культури клітин на лід і промийте клітини холодним PBS.
Аспіруйте PBS, потім додайте холодного буфера для лізису (1 мл на 10 7 клітин/100 мм посуд/150 см 2 колба; 0,5 мл на 5x10 6 клітин/60 мм посудина/75 см 2 колба).
Вишкрібте прикріплені клітини з посуду за допомогою холодного пластикового скребка для клітин, а потім обережно перенесіть суспензію клітин у попередньо охолоджену пробірку для мікроцентрифуги. В якості альтернативи клітини можна трипсинізувати і промити PBS перед ресуспендією в буфері для лізису в пробірці для мікроцентрифуги.
Зберігайте постійне перемішування протягом 30 хв при 4 ° C.
Центрифуга в мікроцентрифузі при 4 ° C. Можливо, вам доведеться змінювати силу та час центрифугування залежно від типу клітини; орієнтир - 20 хв при 12000 об/хв, але це потрібно визначити для вашого експерименту (наприклад, лейкоцити потребують дуже легкого центрифугування).
Обережно вийміть пробірки з центрифуги і поставте на лід, відсмоктуйте супернатант і помістіть у свіжу пробірку, що знаходиться на льоду, і викиньте гранулу.

Приготування лізату з тканин

Розсікайте цікаву тканину чистими інструментами, бажано на льоду і якомога швидше, щоб запобігти деградації протеазами.
Помістіть тканину в пробірки з мікроцентрифугою з круглим дном або пробірки Еппендорфа і занурте в рідкий азот, щоб швидко замерзнути. Зберігайте зразки при -80 ° C для подальшого використання або зберігайте на льоду для негайної гомогенізації.
Для

Додайте шматочок тканини 5 мг

300 мкл крижаного буфера для лізису швидко додайте до пробірки, гомогенізуйте за допомогою електричного гомогенізатора, двічі промийте лезо ще 2 х 300 мкл буфера для лізису, потім підтримуйте постійне перемішування протягом 2 год при 4 ° C (наприклад, помістіть на холодильник). Обсяги буфера лізису повинні визначатися з урахуванням кількості наявної тканини. Білковий екстракт не слід занадто розбавляти, щоб уникнути втрати білка та великих обсягів зразків, що завантажуються на гелі. Мінімальна рекомендована концентрація - 0,1 мг/мл, оптимальна - 1–5 мг/мл).

Центрифуга протягом 20 хв при 12000 об/хв при 4 ° С в мікроцентрифузі. Акуратно вийміть пробірки з центрифуги і поставте на лід, відсмоктуйте супернатант і помістіть у свіжу пробірку, що тримається на льоду. Викиньте гранулу.
U

Визначення концентрації білка

Виконайте аналіз Бредфорда, аналіз Лоурі або біцинхонінову кислоту (BCA). Бичачий сироватковий альбумін (BSA) - це часто вживаний білковий стандарт.
Після визначення концентрації кожного зразка ви можете заморозити їх при -20 ° C або -80 ° C для подальшого використання або підготуватися до імунопреципітації або до завантаження на гель.
U

Підготовка зразків до завантаження в гелі

Денатуровані, зменшені зразки

Антитіла, як правило, розпізнають невелику частину білка, що представляє інтерес (іменований епітопом), і цей домен може знаходитися в межах 3D конформації білка. Щоб забезпечити доступ антитіла до цієї частини, необхідно розгорнути білок, тобто денатурувати його.

Для денатурації використовуйте завантажувальний буфер з аніонним миючим засобом додецилсульфатом натрію (SDS) і кип’ятіть суміш при 95–100 ° C протягом 5 хв. Нагрівання при температурі 70 ° C протягом 5–10 хв також є прийнятним і може бути кращим при вивченні мембранних білків з багатопрохідним проходженням. Вони мають тенденцію до агрегації при кип’ятінні, і агрегати можуть не ефективно потрапляти в гель.

Стандартний завантажувальний буфер називається 2X буфером Леммлі (Laemmli UK, 1970. Розщеплення структурних білків під час складання головки бактеріофага Т4. Nature, 227, 680–5). Він також може бути виготовлений із силою 4X та 6X, щоб мінімізувати розведення зразків. 2X слід змішувати зі зразком у співвідношенні 1: 1.

2x рецепт буфера Леммлі

4% SDS
10% 2-меркаптоетанол
20% гліцерину
0,004% бромофенолового синього
0,125 М Трис HCl
Перевірте рН і доведіть його до рН 6,8

При використанні SDS з білками всі білки стають негативно зарядженими завдяки прикріпленню до аніонів SDS. SDS зв’язується з білками досить специфічно у масовому співвідношенні 1,4: 1. Роблячи це, SDS надає поліпептиду негативний заряд пропорційно його довжині. Денатуровані поліпептиди стають стрижнями негативного заряду з однаковою щільністю заряду на одиницю довжини. Отже, міграція визначається молекулярною масою, а не власним зарядом поліпептиду.

Сорт SDS важливий для високоякісного розділення білків: зафарбований білком фон уздовж окремих гелевих трактів з нечіткими або дещо чіткими білковими смугами свідчить про старий або неякісний SDS. Включення 2-меркаптоетанолу або дитиотрейтолу в буфер зменшує дисульфідні містки, необхідні для поділу за розміром.

Гліцерин додається в буфер завантаження, щоб збільшити щільність завантажуваного зразка і, отже, підтримувати зразок на дні лунки, обмежуючи перелив та нерівномірність завантаження гелю.

Для візуалізації міграції білків прийнято включати невелику молекулу аніонного барвника в завантажувальний буфер (наприклад, бромофеноловий синій). Оскільки барвник аніонний і малий, він буде найшвидше мігрувати з будь-якого компонента суміші, що розділяється, і забезпечить фронт міграції для моніторингу прогресу поділу.

Під час обробки зразків білка пробу слід перемішати за допомогою вихрового переміщення до та після нагрівання для найкращого дозволу.
U

Нативні та нередуковані зразки

В якості альтернативи антитіло може розпізнавати епітоп, що складається з несуміжних амінокислот. Хоча амінокислоти епітопу відокремлені одна від одної в первинній послідовності, вони складаються між собою за складеною тривимірною структурою білка, і антитіло розпізнає епітоп лише у тому вигляді, в якому він існує на поверхні складчаста структура.

За цих обставин важливо проводити вестерн-блот у неденатураційних умовах, і це буде зазначено у таблиці даних у розділі заявок. Взагалі, денатураційний стан просто означає залишення SDS поза зразками та міграційними буферами та не нагрівання зразків.

Деякі антитіла розпізнають білок лише у його нередукованій формі (особливо на залишках цистеїну), а відновники β-меркаптоетанол та DTT повинні залишатися поза завантажувальним буфером та міграційним буфером.

Білковий стан	Стан гелю	Завантаження буфера	Буфер міграції
Знижений, денатурований	Зменшення та денатурація	З 2-меркаптоетанолом або DTT та SDS	З SDS
Зменшений, рідний	Зменшувальне і рідне	З 2-меркаптоетанолом або DTT та SDS	Немає SDS
Окислений, денатурований	Нередукуючий і денатуративний	Ні 2-меркаптоетанол або DTT, з SDS	З SDS
Окислений, рідний	Нередукуючий і рідний	Ні 2-меркаптоетанол або DTT, з SDS	Немає SDS

Емпіричне правило: зменшуйте та денатуруйте, якщо у таблиці даних не вказано інше.

Протоколи надає Abcam “AS-IS” на основі експериментів у лабораторіях Abcam з використанням реагентів та продуктів Abcam; ваші результати використання протоколів поза цими умовами можуть відрізнятися.