Збільшення фосфорилювання тау та усічення тау та зниження рівня синаптофізину у мутантних трансгенних мишей BRI2/тау

Холлі Дж. Гаррінгер

Кафедра патології та лабораторної медицини та Центр хвороби Альцгеймера Індіани, Медичний факультет Університету Індіани, Індіанаполіс, Індіана, Сполучені Штати Америки,

Джилл Меррелл

Ніраджа Саммета

Кафедра патології та лабораторної медицини та Центр хвороби Альцгеймера в Індіані, Медичний факультет Університету Індіани, Індіанаполіс, Індіана, Сполучені Штати Америки,

Аніта Гнезда

Бернардіно Гетті

Рубен Відаль

Задумав і спроектував експерименти: РВ. Виконував експерименти: HJG JM NS AG BG RV. Проаналізовано дані: HJG BG RV. Написав папір: RV HJG BG.

Пов’язані дані

Анотація

Вступ

Гіперфосфорилювання та опосередковане каспазою усічення тау у залишку аспарагінової кислоти (Asp) 421 (Asp 421 або D421, найдовша ізоформа людського тау), як видається, відіграє важливу роль у збиранні тау у нитки [19], [20]. Насправді кілька досліджень in vitro та in vivo свідчать про те, що активація каспази може бути ранньою подією у формуванні NFT [19] - [21]. За допомогою мультифотонної візуалізації in vivo було помічено, що відкладення фібрилярної тау є наслідком клітинного дегенеративного процесу, що відзначається активацією каспази [22]. Після утворення нового клубка в нейроні клітина залишалася живою, і активність каспази, здається, пригнічена. Важливо, що утворення NFT і розщеплення тау в амінокислоті Asp 421 можуть бути спричинені Aβ-пептидами, що зв’язують амілоїд і тау [19].

Тут ми генерували подвійних трансгенних (Tg-FDD-Tau) мишей, схрещуючи трансгенних мишей, що експресують датського мутанта людини BRI2 (Tg-FDD), з мишами, що експресують 4-повторний мутант людини Tau-P301S (Tg-Tau), щоб вивчити взаємозв'язок in vivo між BRI2, ADan і тау. Наші дослідження дають нові in vivo уявлення про патогенез FDD та механістичний зв’язок між ADan, tau та синаптичною патологією.

Матеріали і методи

Трансгенні миші

Заява про етику

Це дослідження було проведено у суворій відповідності до Керівних принципів догляду та використання лабораторних тварин Національного інституту охорони здоров’я. Протокол був схвалений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Університету Індіани (номер протоколу: 10142). Всі операції проводились під наркозом, і всі зусилля докладались до мінімізації страждань тварин.

Випробування Rotarod

Рухова функція мишей WT C57BL/6 (n = 7), Tg-FDD (n = 10), Tg-Tau (n = 11) та мишей Tg-FDD-Tau (n = 9) була перевірена протягом шести місяців старіють за допомогою ротародруду (Columbus Instruments International, Columbus, OH), як описано раніше [26]. Використовували лише наївних мишей. Кожне випробування тривало максимум 10 хв, за цей час обертовий стрижень зазнав лінійного прискорення від 4 до 40 об/хв протягом перших 5 хв випробування, а потім залишався на максимальній швидкості протягом решти 5 хв. Тварин оцінювали за затримку падіння (у секундах) для кожного випробування. Тварини відпочивали мінімум 30 хв між випробуваннями, щоб уникнути втоми та виснаження. Кожна миша проводила чотири випробування в кожен з чотирьох днів поспіль.

Антитіла

Гістологія та імуногістохімія

Мишей знеболювали і перфузію фіксували 4% параформальдегідом в 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,2 (Sigma-Aldrich). Мозок видаляли, вкладали в парафін і розтинали. Зрізи (товщиною 8 мкм) вирізали та встановили на предметних стеклах, покритих полі-1-лізином, і забарвили гематоксиліном та еозином [23], [26], [27]. Деякі зрізи були пофарбовані бодянським срібним фарбуванням. ThS був використаний, щоб показати наявність амілоїдних відкладень у мозку [23], [27]. Імуногістохімічне фарбування зрізів мишей проводили, як описано раніше [23], [27]. Підрахунок клітин проводили на чотирьох мишах Tg-Tau та чотирьох Tg-FDD-Tau у віці 6 та 11 місяців. Окремих мишей кодували, і для кожної тварини мозок послідовно розрізали на корональні зрізи (товщиною 6 мкм) і імунозабарвляли AT8 і Tau-C3 Abs. Загальну кількість позитивних нейронів у всій неокортексі оцінювали на 11 корональних зрізах з інтервалом 180 мкм згідно із стандартним протоколом [28]. Нервові клітини підраховували вручну за допомогою об'єктива 20 × або 40 ×. Щоб уникнути підрахунку одного і того ж нейрона в послідовних зрізах, були включені лише нейрони з ядерцем. Статистичний аналіз був проведений за допомогою GraphPad Prism версії 5.04 (GraphPad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія).

Екстракція білка

Вестерн-блот-аналіз

Концентрації білка визначали за допомогою набору BCA Protein Assay Kit (Pierce). Для аналізу вестерн-блот використовували 40 мкг білка з PNS та розчинних у саркозилі зразків. Для аналізу вестерн-блот використовували п’ять мг тканини мас./Об. (Маса тканини до обробки (мг)/200 мкл буфера зразка) нерозчинних у саркозилі фракцій. Білки розділяли на збірних гелях Mini-Protean TGX (Bio-Rad), пропускали в умовах денатурації та електротрансформували до мембрани PVDF Immobilon (Millipore). Мембрани блокували 0,01% молока в PBS (10 мМ фосфату, pH 7,4, 150 мМ NaCl) 0,05% Tween-20 (PBS-T, все від Sigma), використовуючи систему виявлення білка SNAP ID (Millipore), потім інкубували 2 години або на ніч з первинним Ab. Після промивань буфером PBS-T мембрани інкубували 1 годину з відповідним кон'югованим HRP вторинним Ab і візуалізували за допомогою набору Pierce ECL Pico (Pierce). Щоб забезпечити рівне завантаження білка розчинними зразками та зразками ПНС, помарки зондували анти-β-актином. Плямки сканували та кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення Image J від NIH. Статистичний аналіз проводився за допомогою GraphPad Prism версії 5.04 (програмне забезпечення GraphPad).