Переміщення спектроскопії Рамана в клініку

Молекулярна чутливість спектроскопії КРС робить його перспективним для клінічного застосування: він може ідентифікувати патогени набагато швидше, ніж сучасні методи, досліджувати циркулюючі пухлинні клітини, допомагати хірургам відрізняти пухлини від здорових тканин та визначати хімічну природу серцево-судинних бляшок та оцінювати їх тяжкість.

Сучасне старіння населення представляє великий виклик: забезпечення доступних та стійких систем охорони здоров’я. У міру зростання кількості людей старше 65 років суспільство стикається зі збільшенням вікових захворювань. Відповідно, кількість випадків дегенерації жовтої плями в Німеччині, наприклад, зросте більш ніж удвічі протягом наступних 15 років. Прогнозується подібне збільшення кількості серцевих нападів та нових випадків деменції, тоді як кількість нововиявлених випадків раку зросте на "лише" 50 відсотків. 1 Крім того, нові проблеми, такі як зростаючий ризик пандемії, будуть шукати шляхи вирішення. У той же час часто необережне використання антибіотиків поступово призводить до появи стійких збудників. 2

Для вирішення всіх цих завдань потрібні нові методи та пристрої, за допомогою яких - в ідеалі - можна заразитися та боротися із захворюваннями ще до їх поширення.

Ключовими можуть бути фотонні методи. Фотоніка дозволить зрозуміти розвиток хвороби на молекулярному рівні і, отже, сприятиме персоналізованій медицині. Особливо перспективним і універсальним фотонним методом є спектроскопія КРС та її варіанти. Як і у всіх методах на основі світла, спектроскопія КР дозволяє проводити безконтактні вимірювання, але, на відміну від флуоресцентної спектроскопії, наприклад, вона не вимагає екзогенних міток. Це означає, що методика може суттєво прискорити або навіть замінити лабораторний аналіз та забезпечити діагностику майже у пацієнта, оскільки вона є відносно швидкою та дуже точною. Особливо в області візуалізації слід підкреслити високу специфічність та низьку інвазивність. Подальші переваги спектроскопії КР включають високу просторову роздільну здатність, відсутність потреби у трудомісткій підготовці зразків та здатність працювати у водному середовищі.

Діагностика збудника

Класично діагностика збудників заснована на ініціюванні, зростанні та аналізі культури збудників, що може зайняти до тижня і вимагає досвідченого персоналу. Але у випадку сепсисного шоку, наприклад, рівень виживання різко знижується з кожною годиною, яка проходить перед цілеспрямованим лікуванням, - падаючи до рівня менше 20 відсотків лише через 12 годин. В ідеальному випадку інфекція буде пов’язана з патогеном протягом декількох годин.

Оскільки кожен бактеріальний вид має унікальний раманівський підпис, спектроскопія Рамана добре підходить для його ідентифікації. Крім того, за допомогою мікроскопії Рамана спектру однієї бактерії, як правило, достатньо для ідентифікації.3. Однак розрізнення між спектрами різних видів часто є тонкими, і диференціація за допомогою візуального огляду загалом неможлива. Спектр бактерій в кінцевому рахунку є сумою спектральних сигнатур усіх речовин, що містяться, таких як вода, білки, жири, нуклеїнові кислоти та вуглеводи (рис. 1а). Навіть бактерії одного і того ж виду виявляють незначні варіації, спричинені різницею в стані росту, різними умовами серед пацієнтів, такими як стан харчування та умови лікування, та різною локалізацією у пацієнтів (вогнища інфекції). Для патогенних мікроорганізмів, що знаходяться поза пацієнтом, певну роль відіграють такі фактори навколишнього середовища, як вміст кисню та вуглекислого газу в повітрі, температура та світло.

Фігура 1. (a) Спектри КРС основних біологічних компонентів бактерій: води, білка, нуклеїнових кислот (ДНК), вуглеводів та жирів. У спектрах КРС різних штамів стафілококів, які служать прикладами, можна розпізнати кілька смуг окремих компонентів. (b) Провідник біочастинок від rapID. Зображення надані авторами.
Рішення полягає у застосуванні хімічних методів до спектрів КРС бактерій. У цьому випадку спектр розбивається на окремі ділянки, які математично порівнюються з еквівалентними ділянками в бактеріальних спектрах, зібраних у великій базі даних. В середньому можна правильно визначити майже 99 відсотків видів бактерій, і навіть штам можна визначити із середньою точністю більше 92 відсотків. 3 Для визначення бактеріального забруднення в чистих приміщеннях або системах кондиціонування повітря вже є комерційне відповідне рішення (Bio Particle Explorer від rapID, малюнок 1b). Ця система використовує флуоресцентну спектроскопію для розрізнення між неживими частинками та бактеріями; Потім бактерії ідентифікуються за допомогою спектроскопії Рамана.

Його потенціал для клінічного використання вимагає здатності ідентифікувати бактерії в складних середовищах, таких як слина, сеча або навіть кров. Загалом, бактерії повинні відокремлюватися від цих середовищ; інакше носій заважає ідентифікації або навіть робить це неможливим. Для цього етапу розділення в даний час розробляються мікрофлюїдні мікросхеми, які використовують, наприклад, діелектрофорез для захоплення бактерій і роблять їх доступними для вимірювання. 4 Цей метод також може бути використаний для вимірювання бактерій безпосередньо в розчині і, таким чином, дозволяє - крім ідентифікації - твердження про чутливість або стійкість до антибіотиків.

Онкологічна діагностика

З канцерогенної тканини клітини пухлини можуть відшаровуватися, потрапляти в кров і, зрештою, викликати метастази. Ці ізольовані пухлинні клітини є відносно доступними та мають велике діагностичне значення. З одного боку, їх виявлення допомагає перевірити наявність пухлини та знайти та ідентифікувати її. З іншого боку, стадію первинної пухлини можна визначити на основі циркулюючих пухлинних клітин, і можна оцінити успіх хіміотерапії.

Принцип виявлення суттєво відповідає принципу оптичної проточної цитометрії: кров пропускається через мікрорідку мікросхему; Потім окремі клітини захоплюють оптичними пастками, досліджують за допомогою спектроскопії КРС, класифікують та сортують для подальшого використання.

У порівнянні з оптичною проточною цитометрією, метод Рамана дозволяє набагато точніше діагностувати окрему клітину. Недоліком є набагато менша пропускна здатність (від п’яти до шести комірок на хвилину), але це можна значно покращити в майбутньому за допомогою модернізації, пов’язаної з пристроями та компонентами.

На малюнку 2 показано мікрожидкостну мікросхему, виготовлену з кварцу для сортування клітин, активованих Раманом. 5 На необроблені спектри КРС впливають спектральні властивості фільтрів, уловлюючих лазерів та матеріалу підкладки. Тому успішна класифікація вимагає придушення цих властивостей, щоб спектральний відбиток лейкоцитів (зелений) та пухлинних клітин (оранжевий, коричневий, синій) став видимим.

Перевага CARS перед Raman полягає у набагато коротшому часі запису зображення (до коефіцієнта 104) завдяки сильному збільшенню перерізу розсіювання. На відміну від Raman та CARS, SHG та TPEF наголошують на морфологічних деталях: SHG особливо чутливий до впорядкованих нецентросиметричних структур, таких як колаген, тоді як TPEF реагує на ендогенні флуоресцентні речовини, такі як NAD (P) H, флавіни та еластин.

На малюнку 3 порівнюються мікроскопічні зображення TPEF, CARS та Raman нефарбованого тонкого зрізу пухлини мозку з мікроскопічним зображенням того самого зразка після фарбування гематоксиліном та еозином. Клітинні ядра, які вирішуються усіма методами, представляють інтерес для гістопатологічної оцінки. За допомогою комбінованої морфологічної та функціональної інформації за допомогою мультимодального підходу великі шанси на розробку фотонних інструментів, які не тільки можуть рано виявити та класифікувати пухлини, але також дозволяють розташувати межі пухлини під час операції.

Потенційним застосуванням спектроскопії КР in vivo є ендоскопічне дослідження артеріальних бляшок. Звичайні методи, такі як внутрішньосудинне ультразвукове дослідження або оптична когерентна томографія, як правило, дають лише морфологічну інформацію. Для оцінки того, чи небезпечний осад в артерії - тобто може відірватися від стінки судини і спричинити закупорку, а отже, серцеві напади або інсульти - оцінка складу нальоту має важливе значення.

Спектри КРС потенційних компонентів бляшок - фосфату кальцію, сполучної тканини, тригліцеридів та холестерину - добре розрізнюються, тому ендоскопічна спектроскопія КРС може в основному визначити склад нальоту, а отже, і небезпеку відкладень.

Перші експерименти на кроликах підтвердили цінність цього підходу. Як показано на малюнку 4, для запису спектрів КРС в умовах in vivo використовували зонд діаметром 1 мм із волокном центрального збудження та 12 волокнами детектування для вимірювань ex vivo7. Сигнали відкладень нальоту відрізняються за інтенсивністю та спектральним вкладом ліпідів від сигналів артеріальної стінки з колагеновими смугами та від крові з смугами еритроцитів. Подальші розробки спрямовані на поєднання Рамана з оптичною когерентною томографією та/або ультразвуком для злиття морфологічної інформації з конкретною молекулою. Крім того, планується мініатюризація для дослідження артерій меншого діаметру.

Доктор Томас Майерхофер - старший науковий співробітник Інституту фотонних технологій Лейбніца в Єні, Німеччина; електронна адреса: thomas.mayer [email protected]. Доктор Крістоф Краффт - керівник робочої групи з питань спектроскопії/візуалізації в Інституті фотонних технологій Лейбніца; електронна адреса: [email protected]. Доктор Уте Нойгебауер - молодший керівник дослідницької групи в Інституті фотонних технологій Лейбніца та Центрі контролю та догляду за сепсисом в Університетській лікарні Єни; електронна адреса: [email protected]. Доктор Юрген Попп - науковий керівник Інституту фотонних технологій Лейбніца, член Центру контролю та догляду за сепсисом в університетській лікарні Єни та директор Інституту фізичної хімії Університету Фрідріха Шиллера в Єні; електронна адреса: [email protected].

Подяка

Автори дякують Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur (Project-B714-07037), Федеральному міністерству освіти і досліджень (FKZ: 01EO1002/FKZ: 13N10774) та Європейському Союзу за фінансову підтримку.

Список літератури

1. Ф. Беске та ін (2009). Morbiditätsprognose 2050: Ausgewählte Krankheiten für Deutschland, Brandenburg und Schleswig-Holstein. Кіль: Institut für Gesundheits System Forschung.

2. Європейський центр з профілактики та контролю захворювань (березень 2013 р.). Річний епідеміологічний звіт за 2012 рік. Звітність про дані спостереження 2010 року та дані епідемічної розвідки 2011 року. Стокгольм: ECDC.

3. М. Гарц та ін. (Лютий 2009 р.). Вібраційна спектроскопія - потужний інструмент для швидкої ідентифікації мікробних клітин на одноклітинному рівні. Цитометрія А, вип. 75А, с.104-113.

4. У.-Ч. Шредер та ін (2013). Незалежне від культури виявлення збудників сепсису з бактеріурій: нова комбінація діелектрофорезу та мікро-комбінаційної спектроскопії. Інфекція, вип. 41 (додаток 1), P036.

5. С. Дохув та ін. (Березень 2013 р.). Кварцовий мікрофлюїдний чіп для ідентифікації клітин пухлини методом спектроскопії КР у поєднанні з оптичними пастками. Anal Bioanal Chem, Vol. 405, с. 2743-2746.

6. Т. Мейєр та ін (10 лютого 2011 р.). Нелінійна мікроскопія, інфрачервона та мікроспектроскопія комбінаційного спектру для аналізу пухлини мозку J Biomed Opt, Vol. 16, с. 021113.

7. C. Matthäus et al (вересень 2012 р.). Характеристика in vivo відкладень атеросклеротичних бляшок методом зондової спектроскопії та когерентного мікроскопічного візуалізаційного розсіювання анти-Стокса за методом Рамана за методом кролика. Anal Chem, Vol. 84, с. 7845-7851.