Остеопонтин регулює атрофію лімфоїдних органів, спричинену розвантаженням кінцівок, і втрату ваги шляхом модуляції вироблення кортикостероїдів

Відредаговано Харві Кантором, Інститут раку Дани-Фарбера, Бостон, Массачусетс, та затверджено 19 липня 2007 р. (Отримано на огляд 7 квітня 2007 р.)

Анотація

Остеопонтин (OPN) - це багатофункціональний білок, який бере участь як в адгезії клітин, так і в клітинній сигналізації завдяки своїй взаємодії з певними інтегринами та варіантами CD44. Він бере активну участь у багатьох фізіологічних та патологічних процесах, включаючи реконструкцію тканин та виживання клітин (1, 2). OPN визначено як головний фактор, що регулює імунні реакції та запалення; його експресія регулюється вгору в активованих Т-клітинах, макрофагах та природних клітинах-кілерах (3, 4). Він класифікується як Т-хелпер-1 (Th1) цитокін, оскільки він посилює вироблення цитокінів Th1 IFN-γ та IL-12 та інгібує вироблення цитокіну T-хелпера-2 (Th2) IL-10 (5, 6). Хоча це прозапальний цитокін, асоційований з аутоімунними захворюваннями, запальною реакцією Th1, функцією В-клітин та функцією природних Т-клітин-кілерів, він також має протизапальні функції, такі як інгібування індукції індуцибельної синтази оксиду азоту та інгібування продукції цитокінів Th2. (7–14). Його підвищення регуляції також є ознакою багатьох основних патологічних розладів, таких як серцево-судинні захворювання, рак та захворювання легенів (12, 15).

Експресія OPN збільшується у відповідь на різні стресові фактори, включаючи фізичний та хімічний стрес (16, 17). Зв'язок між стресом та імунною функцією продемонстровано в різних експериментальних парадигмах (18). Стрес може або посилити, або погіршити функцію імунної системи залежно від її типу та тривалості. Гормони стресу, такі як кортизол, відіграють ключову роль в модуляції прозапальних/протизапальних реакцій та балансу цитокінів TH1/Th2, впливаючи тим самим на сприйнятливість та результат різних захворювань, пов'язаних з імунітетом (19). У той час як хронічний стрес є імунодепресивним і призводить до підвищеної вразливості до інфекцій та раку, гострий стрес сприяє імунопротекції через опосередкований клітинами імунітет (20–22). Наскільки нам відомо, роль OPN у відповіді імунних органів на стрес не вивчалася.

Результати

Дефіцит OPN захищає мишей від втрати ваги та атрофії лімфоїдних органів.

HU викликає значну атрофію лімфоїдних органів. Селезінку та тимус розсікали від контрольних та підвішених мишей. Хірургічно витягнуті цілі органи поміщали в посуд для культури клітин, наповнений середовищем, і сканували на цифровому сканері.

OPN -/- миші стійкі до HU-індукованої апоптотичної загибелі клітин як у тимусі, так і в селезінці. Мишей дикого типу та OPN -/- піддавали HU протягом 20 год. TUNEL-позитивні апоптотичні клітини в парафінових зрізах тканин селезінки та тимусу показані темно-коричневим кольором на метилово-зеленому забарвленому фоні.

OPN сприяє стресовій втраті спленоцитів та незрілих Т-клітин у тимусі.

Розподіл субпопуляції лімфоцитів у селезінці та тимусі

Аналіз субпопуляцій лімфоцитів методом проточної цитометрії. (А) Тимоцити, виділені із суспендованих та контрольних мишей OPN +/+ та OPN -/-, забарвлювали кон’югованими фторхромом анти-CD8 та анти-CD4 антитілами та аналізували за допомогою проточної цитометрії. Гістограми вказують кількість клітин у різних субпопуляціях мишей OPN +/+ та OPN -/- (середнє значення ± SEM, n = 4–7 тварин). (B) Спленоцити, виділені із суспендованих та контрольних мишей OPN +/+ та OPN -/-, забарвлювали кон’югованими фторхромом анти-B220, anti-CD8 та анти-CD4 антитілами та аналізували за допомогою проточної цитометрії. Дані представляють середнє значення ± SEM чотирьох-семи тварин у кожній точці даних. ***, Статистичне значення у P -/- Мишей, підданих HU.

Кортикостерон, головний гормон стресу у гризунів, швидко регулюється у відповідь на стрес, що призводить до індукції значного апоптозу лімфоцитів (19). Цікаво, що було показано, що блокування стероїдних рецепторів у мишей може пригнічувати HU-індуковане зменшення лімфоцитів (24). Щоб визначити, чи OPN відіграє роль у регулюванні продукції глюкокортикоїдів після HU, ми вимірювали рівні кортикостерону та OPN у сироватці крові мишей після HU. Ми виявили, що хоча рівень OPN не змінювався у мишей OPN +/+ (дані не наведені), HU спричинив ≈5-кратне збільшення рівня кортикостероїдів у сироватці мишей OPN +/+, але не у мишей OPN -/- (Рис. 6). Цей висновок свідчить про те, що OPN необхідний для регуляції стероїдного гормону у відповідь на стрес, спричинений HU. Коли екзогенний дексаметазон надходив до клітин, виділених від мишей OPN +/+ та OPN -/-, не було різниці в швидкості індукованої загибелі клітин (рис. 7), що вказує на те, що індукована стероїдами загибель лімфоїдних клітин не порушується в OPN -/- клітини. Висновок полягає в тому, що ендогенний OPN діє вище за гормон кортикостерону, можливо, сприяючи його підвищеному продукуванню у відповідь на стрес, викликаний HU, і тим самим опосередковано сприяючи загибелі лімфоїдних клітин.

Індукована дексаметазоном загибель клітин не погіршувалась у мишей OPN -/-. Клітини OPN +/+ та OPN -/- обробляли дексаметазоном протягом 16 год при 37 ° C, а відсоток решти живих клітин оцінювали за допомогою проточної цитометрії з фарбуванням йодидом пропідію. WT, дикий тип; КО, нокаут; спл, селезінка; ти, тимус.

OPN регулює розповсюдження імунних клітин та вироблення цитокінів у відповідь на HU.

OPN причетний до вроджених та адаптивних імунних реакцій, наприклад, вербування макрофагів та лімфоцитів до місць пошкодження та регулювання їх діяльності. Його експресія підвищується у відповідь на механічні навантаження в кістці та судинній системі (12, 25, 31). Рівні OPN також підвищені у відповідь на окислювальний стрес, що існує в пухлинах, після реперфузійної травми, а також при запальних захворюваннях, таких як запальна хвороба чаші, хронічна обструктивна хвороба легень та хвороба Паркінсона (17, 32, 33). Наш висновок про те, що миші, у яких відсутня OPN, менш схильні до стресової атрофії лімфоїдних органів, інтригує, оскільки означає, що OPN функціонує як медіатор стресу.

Аналіз мікрочипів показав, що OPN необхідний для посиленої експресії гена p53 у мишей HU (34). Підвищений рівень р53 спонукає клітини до апоптозу або припинення ділення у відповідь на шкідливий вплив стресу; однак роль p53 в індукованому HU апоптозі в лімфоцитах не досліджена. Наші результати показали меншу втрату клітин у мишей OPN -/- після 3 днів HU, що відповідає зменшенню реакції p53 у мишей OPN -/-. Ці дані показують, що OPN діє як опосередковувач сигналів стресу вище за течією від генів, що регулюють апоптоз та біосинтез або вивільнення кортикостерону. Цікаво відзначити, що Марш та ін. (39) повідомили, що миші OPN -/- збільшили механосенсорні пороги, можливо, сприяючи підвищеній толерантності до напружень, накладених у цьому дослідженні.

Матеріали і методи

Мишей OPN -/- генерували (37) та утримували в 129 фоновому режимі разом з ізогенними засобами контролю дикого типу в тваринницькому комплексі Рутгерса Нельсона (Піскатейвей, Нью-Джерсі), який акредитований Асоціацією з оцінки та акредитації лабораторних тварин Догляд і знаходиться під опікою сертифікованого ветеринарного лікаря. Усі тварини, які використовувались в експериментах, відповідали віку та статі.

Розвантаження задніх кінцівок.

Мишей виводили в клітку індивідуально і підвішували на 3 дні за хвіст, використовуючи смужку клейкої хірургічної стрічки, прикріплену до ланцюга, що висить на шківі. Мишей підвішували під кутом 25 ° до підлоги, лише передні кінцівки торкалися підлоги (24, 38). Їжа та вода постачались за бажанням. Контрольних мишей утримували за подібних умов, за винятком того, що їх не призупиняли. Цей протокол був схвалений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Рутгерса (№ 97: 031). Мишей зважували до та після піддавання HU.

Кількість клітин та аналіз поверхневих маркерів.

Через 3 дні HU мишей вбивали вдиханням СО2. Вирізали тимус і селезінку та готували одноклітинні суспензії. Загальну кількість клітин визначали гемоцитометром. Специфічні субпопуляції лімфоцитів були ідентифіковані на основі маркерів клітинної поверхні методом проточної цитометрії; використовували кон'юговані флуоресценцією моноклональні антитіла, включаючи CD4, CD8 та CD45R/B220 проти мишачих щурів (усі від BD Biosciences – PharMingen, Сан-Дієго, Каліфорнія). Клітини інкубували з BD Fc Block (BD Biosciences – PharMingen), щоб блокувати неспецифічне зв’язування перед фарбуванням. Фарбування визначали FACScalibur (Бектон Дікінсон, Сан-Хосе, Каліфорнія). Дані отримували та аналізували за допомогою програмного забезпечення CellQuest.

Визначення кортикостерону в сироватці крові.

Кров відбирали у експериментальних та контрольних мишей OPN +/+ та OPN -/- відразу після HU. Сироватку збирали і зберігали при -80 ° C. Рівні кортикостерону у зразках сироватки оцінювали за допомогою набору кортикостерону ELISA від IBL America (Міннеаполіс, Міннесота) відповідно до інструкцій виробника.

Індукція апоптозу дексаметазоном.

Одноклітинні суспензії спленоцитів і тимоцитів культивували в 96-лункових планшетах по 10 6 клітин на лунку в присутності дексаметазону в різних концентраціях. Після 16-годинної інкубації при 37 ° C клітини промивали PBS і фарбували йодидом пропідію в присутності 100 мкг/мл РНКази/0,1% сапоніну. Відсоток апоптотичних клітин визначали за допомогою аналізу вмісту ДНК за допомогою проточної цитометрії.

Виявлення апоптозу Situ (аналіз TUNEL).

Фрагментацію ядерної ДНК в апоптотичних клітинах було виявлено на парафінових зрізах за допомогою набору для виявлення апоптозу TACS.XL DAB in situ від Trevigen (Gaithersburg, MD). Включення BrdU термінальною дезоксинуклеотидилтрансферазою в місці фрагментації ДНК було виявлено за допомогою високоспецифічного та чутливого біотінільованого анти-BrdU антитіла та візуалізовано кон’югатом стрептавідин – пероксидаза хрону. Зрізи тканини були забарвлені метиловим зеленим.

Аналіз розмноження Т-клітин.

Одноклітинні суспензії тимоцитів і спленоцитів висівали в 96-лункові планшети, які попередньо покривали анти-CD3 при 5 мкг/мл у PBS протягом 24 годин при 4 ° C. Клітини висівали по 5 × 10 5 клітин на лунку в повному середовищі (середовище RPMI 1640/10% інактивованого теплом FBS/55 мкМ 2-меркаптоетанол/2 мМ л -глютаміну/50 одиниць/мл пеніциліну/50 мкг/мл стрептоміцину) доповнений 1 мкг/мл анти-CD28. Клітини культивували протягом 3 днів, а потім мітили [3 H] тимідином протягом 16 годин. Включення [3 H] тимідину вимірювали за допомогою підрахунку β-сцинтиляції.

Визначення продукції цитокінів.

Надосадові рідини тимоцитів або спленоцитів, стимульованих анти-CD3/анти-CD28, збирали через 48 годин. Цитокіни IL-2, IL-10 та MCP-1 вимірювали за допомогою наборів ELISA DuoSet (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота), відповідно до інструкцій виробника.

Статистичний аналіз.

Кожен експеримент проводили принаймні двічі з трьома і більше мишами в кожній групі. Дані виражаються як середнє значення ± SEM. Відмінності між групами аналізували за допомогою критерію t Стьюдента, пов'язаного з програмним забезпеченням Excel.

Подяка

Ми дякуємо Девіду Шену за допомогу з цифровими цифрами, Гетті Денхардт і Буміці Десай за технічну допомогу, а Гуанвен Рену та Артуру І. Робертсу за допомогу в розвантаженні задніх кінцівок. Цю роботу частково підтримали грант біологічних медичних досліджень Busch 649164 (DTD), грант Національного товариства розсіяного склерозу 3699A10 (DTD), грант Фонду комерціалізації технологій Rutgers 04-2042-014-32 (DTD) та Національне космічне біомедичне дослідження Інститут Грант IIH00405 (для YS), який підтримується Національним управлінням аеронавтики та космосу через Угоду про співпрацю NCC 9-58.

Виноски

Вклад автора: Ю.С. та D.T.D. внесли однаковий внесок у цю роботу; K.X.W. та D.T.D. розроблені дослідження; K.X.W. та D.T.D. виконані дослідження; K.X.W. та Ю.С. проаналізовані дані; та K.X.W., Y.S. та D.T.D. написав роботу.

Автори не заявляють конфлікту інтересів.

Ця стаття є прямим поданням PNAS.