Онтогенез метаболізму глюкози у райдужної форелі (Oncorhynchus mykiss) у світлі нещодавно

АНОТАЦІЯ

ВСТУП

Метою цього дослідження було проаналізувати гени метаболізму глюкози, тобто гени, що належать до двох основних шляхів, пов'язаних з глюкозою: гліколізу та глюконеогенезу (рис. S1), щоб: (i) виявити та охарактеризувати еволюцію дубльованих генів гліколізу в райдужна форель (тобто фосфофруктокіназа печінки та піруваткіназа печінки); (ii) визначити схему експресії дубльованих генів, пов’язаних з метаболізмом глюкози, тобто гліколітичних генів (глюкокіназних паралогів, gcka та gckb; паралогів фосфофруктокінази печінки, pfkla та pfklb; піруваткінази печінки та еритроцитів, pklr) та глюконеогенних генів (цитозольний мітохондріальні фосфоенол-піруват-карбоксикінази pck1 та pck2, відповідно; фруктоза 1,6-бісфосфатаза 1 паралоги fbp1a, fbp1b1 та fbp1b2; паралоги глюкози 6-фосфатази g6pca, g6pcb1.a, g6pcb1.b, g6pbc, gb gb, gb, gb, gb, gb, gb, gb, gb. відповідна загальна активність ферментів на критичних стадіях розвитку онтогенезу печінки; та (iii) вивчити схему експресії цих генів під час харчового переходу від ендогенного до екзогенного харчування у форелі, яка харчується дієтою, що не містить вуглеводів або з високим вмістом вуглеводів.

онтогенез

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Заява про етику

Експеримент проводився у суворій відповідності з правовими рамками ЄС, що стосуються захисту тварин, що використовуються в наукових цілях (директива 2010/63/ЄС) та керівними принципами французького законодавства, що регулює етичне поводження з тваринами (указ № 2001-464, 29 травня 2001 р.). Він був затверджений Дирекцією Departementale des Services Veterinaires (Французька ветеринарна служба) для проведення експериментів на тваринах (INRA 2002–36, 14 квітня 2002). Експериментальна станція INRA сертифікована для експериментів на тваринах за дозволом №. A64.495.1 Французької ветеринарної служби, відповідного органу.

Рибні дієти

Два експериментальні корми для алевінів райдужної форелі, тобто no-CHO (дієта без вуглеводів) та високо-CHO (дієта з дуже високим вмістом вуглеводів), були приготовані на наших власних підприємствах (INRA, Donzacq, Landes, France) у вигляді екструдованих гранул. В якості джерел вуглеводів були включені глюкоза та желатинізований крохмаль; білок походить з рибної муки, а ліпідні речовини, що містяться в їжі, з риб’ячого жиру та рибного борошна (табл. 1). Дві дієти мали однакову кількість ліпідів. Велике збільшення вмісту вуглеводів у їжі (~ 60%) у дієті з високим вмістом СНО компенсувалося меншою часткою білка (~ 20%). Ніяких вуглеводів не додавали до дієти без вмісту СНО, яка містила приблизно 60% сирого білка.

Склад і приблизний склад двох експериментальних дієт (без СНО та високої СНО)

Риба та експериментальний дизайн

Аналіз дієт

Хімічний склад дієт аналізували за допомогою наступних процедур: суху речовину аналізували після сушіння при 105 ° С протягом 24 год, вміст ліпідів отримували екстракцією петролейного ефіру (Soxtherm), вміст білка (N × 6,25) отримували Методом Кельдаля після перетравлення кислоти валову енергію вимірювали в калориметрі адіабатичної бомби (IKA, Heitersheim Gribheimer, Німеччина), а вміст золи вимірювали спалюванням зразків у муфельній печі протягом 6 год при 600 ° C.

Аналіз складу тіла ооцитів, ембріонів та ендогенних живильних алевінів

Вміст глікогену та глюкози аналізували у 600 мг об’єднаної риби (ооцити, ембріони від 2-ї до 23-ї стадії та ендогенні харчові алевіни, 31-та стадія). Вміст глікогену визначали методом гідролізу, раніше описаним Good et al. (1933). Кожен зразок подрібнювали в 1 моль л -1 HCl (VWR, США). На цьому етапі зберігали аліквоту для вимірювання вмісту вільної глюкози. Через 10 хв центрифугування при 10000 g, вільну глюкозу вимірювали за допомогою флуориметричного глюкозного набору Amplite ™ (AAT Bioquest ®, Inc., США) відповідно до інструкцій виробника. Решту розмеленої тканини кип'ятили при 100 ° C протягом 2,5 год, а потім нейтралізували 5 моль л -1 КОН (VWR, США). Потім рН розчину регулювали до 7,4 і вимірювали загальну глюкозу (вільна глюкоза + глюкоза, отримана в результаті гідролізу глікогену), використовуючи той самий набір, що і раніше. Вміст глікогену оцінювали шляхом віднімання рівня вільної глюкози.

Загальний вміст ліпідів визначали в двох примірниках методом сульфофосфованілуну, описаним Барнсом та Блекстоком (1973), використовуючи стандарт риб'ячого жиру (Сопропече, Булонь-сюр-Мер, Франція) замість холестерину.

Загальний вміст білка також вимірювали в двох примірниках, використовуючи метод Кельдаля, як для аналізу дієти.

В аналізі silico

Ортологічні гени pfkl та pklr в геномі веселки форелі (Berthelot et al., 2014) були ідентифіковані в браузері геному Oncorhynchus mykiss (Genoscope: http://www.genoscope.cns.fr/trout/), вилученому з бази даних SIGENAE ( http://www.sigenae.org) за допомогою інструменту BLAST (усі номери приєднання наведені в таблиці 2). Послідовності з інших видів були зібрані з бази даних Геном Ensembl (випуск Ensembl 77, жовтень 2014 р .: http://www.ensembl.org). Інструмент аналізатора послідовностей із програмного забезпечення EMBL Pfam (http://pfam.xfam.org) був використаний для підтвердження ідентичності послідовностей. Програмне забезпечення Genomicus, v01.01 (http://www.genomicus.biologie.ens.fr/genomicus-trout-01.01/cgi-bin/search.pl) було використано для підтвердження ідентичності генів pfkl.

Послідовності праймерів та номери приєднання для аналізу qPCR

Філогенетичний аналіз pklr (рис. 1) проводили за допомогою програмного забезпечення MEGA v6 (Tamura et al., 2013), як описано раніше (Marandel et al., 2015). Філогенетичне дерево, засноване на виведених повнорозмірних амінокислотних послідовностях, було створено методом приєднання сусідів (NJ) та підтверджено методом мінімальної еволюції (дані не наведені). Надійність виведених дерев оцінювали за допомогою методу bootstrap з 1000 повторень. Для коренеутворення дерева використовували білкову послідовність Petromyzon marinus pk (Ensembl Accession ENSPMAP00000000233). Еволюційні відстані обчислювали за допомогою методу корекції Пуассона (Цукеркандль, 1965) і виражали в одиницях кількості заміщень амінокислот на сайт. В аналізі брали участь 10 амінокислотних послідовностей. Усі позиції, що містять прогалини та відсутні дані, були ліквідовані, залишивши загалом 127 позицій у кінцевому наборі даних.

Філогенетичний аналіз Pklr (піруваткінази печінки та еритроцитів). Виведені амінокислотні послідовності вирівнювали за допомогою програмного забезпечення MUSCLE (Едгар, 2004). Філогенетичний аналіз проводили за допомогою програми Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) v6.0 (Tamura et al., 2013). Філогенетичне дерево було побудоване методом приєднання сусідів (NJ). Надійність виведеного дерева оцінювали за допомогою методу bootstrap з 1000 повторень. Для коренеутворення дерева використовували послідовність pklr міноги (Petromyzon marinus, Ensembl ID: ENSPMAP00000000233). Номери приєднання білка наведені в дужках.

Нові анотації генів були виділені згідно з керівництвом номенклатури ZFIN (http://zfin.org/). Всі послідовності та виведені часткові амінокислоти наведені на рис. S2.

Загальна екстракція РНК та синтез кДНК

Відносну експресію гена визначали за допомогою кількісної RT-PCR у реальному часі. Зразки гомогенізували за допомогою Precellys ® 24 (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, Франція): (1) у пробірках об’ємом 7 мл, що містять реактив Trizol (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) та керамічні кульки розміром 2,8 мм протягом 2 × 30 с, розділені через 15 с при 5500 об/хв для ооцитів та ембріонів (30 на зразок та на нерест); та (2) у пробірках об’ємом 2 мл, що містять реактив Тризол (Invitrogen) та керамічні кульки 2,8 мм протягом 2 × 20 с, розділених 15 с, при 5500 об/хв для алевінів (1 алевін на пробірку, 6 алевінів на нерест/дієту для змішаних та екзогенне живлення риби). Контрольну РНК люциферази (Promega), 10 пг на 1,9 мг ембріона/алевіну або ооцита, додавали до кожної проби, щоб забезпечити нормалізацію даних під час раннього розвитку, як описано раніше (Desvignes et al., 2011; Marandel et al., 2012) . Потім РНК витягували згідно з інструкціями виробника. Загальну РНК (1 мкг) використовували для синтезу кДНК. Набір H-зворотної транскриптази Super-Script III RNAse (Invitrogen) був використаний із випадковими праймерами (Promega, Charbonniéres, Франція) для синтезу кДНК.

RT-PCR у реальному часі

Загальна активність ферментів

Статистичний аналіз

Нормальність розподілу оцінювали за допомогою критерію Шапіро – Вілька. Далі дані аналізували за допомогою непараметричного тесту Крускала – Уолліса з подальшим тестом Тукі як пост-хок аналіз. Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення R (v3.1.0)/R Commander Package.

РЕЗУЛЬТАТИ

In silico аналіз генів pfkl та pklr райдужної форелі

У геномі райдужної форелі не було виявлено ортологічного гена pklr (або за допомогою програмного забезпечення Genomicus, або за допомогою прямого BLAST проти геному райдужної форелі), але EST-контиґ (Sigenae, AF246146.s.om.10), що має гомологію високої послідовності (близько 75%) з телеостними генами pklr було виявлено. Філогенетичний аналіз був проведений, щоб підтвердити його ідентичність, і це показало, що контиг визначений згрупованим з ортологами хребетних pklr (рис. 1). Більше того, аналіз Pfam підтвердив, що послідовність форелі була пов'язана з геном, що кодує піруват-кіназу. На закінчення, наш силіко-аналіз ідентифікував два паралогічні гени pfkl в геномі райдужної форелі, один ортологічний pfkla у даніо (ешафот 7584), а інший у даніо pfklb (ешафот 8651, GSONMG00001975001), і один ортологічний ген pklr (Sigenae) AF246146.s.om.10).

Аналіз експресії та загальна ферментативна активність генних продуктів, пов'язаних з метаболізмом глюкози, під час розвитку ембріона

ПЛР у режимі реального часу проводили для визначення стадії специфічної експресії генів, пов’язаних із метаболізмом глюкози веселки, форелі під час ембріогенезу та у виведених алевінах. Етапи були визначені на основі таблиці розвитку Верньє (Верньє, 1969) і обрані для цільових періодів розвитку, що становлять інтерес для дослідження метаболізму глюкози [тобто ооцит до стадії 8, до активації ембріонального геному (EGA); етап 10, EGA; стадії 12 і 15, епіболічний період; стадія 22, примітивна печінка; стадія 23, примітивна печінкова ворітна вена і стадія 31, вилуплений ембріон/ендогенний період живлення]. Цей аналіз показав (рис. 2), що рівні мРНК усіх генів метаболізму глюкози зростали після EGA (стадія 10), щоб досягти максимального рівня на стадіях 22 і 23, за винятком g6pcb1.b та g6pcb2.b, рівні мРНК яких зросли до стадії 31.

Схема експресії глюконеогенних та гліколітичних генів під час розвитку. Дані - відносна кількість глюконеогенних (ліворуч) та гліколітичних (праворуч) генів під час розвитку. Ембріони відбирали зразки згідно Верньє (1969) на стадіях О (ооцити), 2, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 22 і 23 та 31 (алевін). Для всіх стадій рівень експресії генів нормалізувався за величиною екзогенної РНК люциферази. Дані виражаються у середніх значеннях ± м.м. (N = 3 пули ембріонів, один пул з 30 ембріонів на нерест). Різні літери вказують на суттєві відмінності між умовами (P Переглянути цю таблицю:

  • Переглянути вбудований
  • Переглянути спливаюче вікно
  • Завантажте PowerPoint

Загальна активність ферментів

Склад тіла під час розвитку ембріона

Для того, щоб простежити відносне споживання макроелементів в ембріоні та запасах жовтка під час розвитку, вимірювали рівень білка, ліпідів та вуглеводів (тобто глюкози та глікогену). Під час розвитку статистично значущих коливань рівня ліпідів або білка не спостерігалось (табл. 4). Хоча загальний вміст вуглеводів в ембріонах (табл. 4, рис. 3) суттєво не змінювався під час розвитку, він, здавалося, зменшувався на стадіях 22 і 23, як і вміст глікогену (рис. 3).

Склад тіла ембріонів та виведених алевінів