Однокомбінована генна терапія лікує безліч вікових захворювань

Автор: Джордж М. Черч, 20 серпня 2019 р. (Надіслано на огляд 20 червня 2019 р .; переглянуто Обрі де Грей та Жоао Педро Магалхаесом)

Ця стаття має виправлення. Дивіться:

Значимість

Тривалість життя людей і тварин безпосередньо пов’язана із станом здоров’я. Хоча попередні дослідження дали докази, що підтверджують цей зв’язок, терапевтичне впровадження цих знань було обмеженим. Традиційно хвороби досліджуються та лікуються індивідуально, що ігнорує взаємозв’язок вікових станів, вимагає багаторазового лікування не пов’язаних між собою речовин та збільшує накопичувальний ризик побічних ефектів. У цьому дослідженні ми розглядаємо та долаємо цей глухий кут шляхом створення генетичних методів лікування старіння на основі аденоасоційованих вірусів (AAV) для одночасного лікування кількох вікових захворювань. Ми демонструємо модульну та розширювану природу комбінованої генної терапії, випробовуючи терапевтичні коктейлі AAV, які стикаються з багатьма захворюваннями в одному лікуванні. Ми спостерігали, що 1 лікування, що включає 2 генетичні терапії AAV, було ефективним проти всіх 4 захворювань.

Анотація

У цій роботі ми розробили та протестували 3 генні терапії на основі AAV та вводили їх дорослим нетрансгенним мишам для лікування 4 вікових захворювань. 3 генами, що брали участь у цих терапіях, були фактор росту фібробластів 21 (FGF21), αKlotho та трансформуючий фактор росту-β1 (TGFβ1). Ці 3 гени були обрані завдяки їхній відомій корисній ролі у старінні та специфічних станах хвороби (4 ⇓ –6). FGF21 та αKlotho є циркулюючими факторами, що виробляються печінкою та нирками, відповідно (5, 13 ⇓ –15), а TGFβ1 є секретованим фактором, експресія якого не обмежується певним органом (16). FGF21 визначив ролі в обміні речовин та обробці глюкози (17), αKlotho - відомий регулятор внутрішньоклітинного кальцію та забезпечує захист при патологіях серця та нирок (18, 19), а сигналізація TGFβ1 відіграє важливу роль у віковій гіпертрофічній кардіоміопатії, імунній вербування та формування позаклітинного матриксу (20). Хоча ці 3 гени відіграють відому роль у різних стадіях захворювання, пов'язаних з віком, залишається невідомим, чи може їх одночасне збурення забезпечити адитивний, синергетичний або шкідливий фенотип при будь-якому даному захворюванні.

Результати

Ми обрали AAV як метод доставки генної терапії завдяки його безпеці, низькій імуногенності, простоті виготовлення, здатності заражати клітини, що діляться та не діляться, та зростаючій кількості успішних клінічних випробувань на людях (21 ⇓ –23). Ми розпочали із створення 3 окремих векторів AAV8 для надмірного вираження миші FGF21, розчинної форми миші, що трансформує фактор росту-β-рецептора 2 (sTGFβR2), який зв'язує та пригнічує TGFβ1 (24), та миші α Клото (Методи та додаток SI, рис. S1A) . Серотип AAV8 був обраний вектором доставки через його високий рівень зараження печінки (25), органу, добре відомого своєю здатністю виробляти високий рівень секретованих білків (26) та природної тканини для ендогенної експресії FGF21 (4) . Після генерації та ін'єкції кожного вірусу ми підтвердили надмірну експресію відповідних трансгенів безпосередньо або з їх подальшого впливу в плазмі миші, використовуючи імуноферментний аналіз (ELISA) та вестерн-блот (Методи та додаток SI, рис. S1 B – D) і виявили до 17-кратного збільшення FGF21, 95% зменшення циркулюючого TGFβ1 та збільшення ∼10 × циркулюючого αKlotho. Ми також проводили повний розтин мишей, яким вводили нашу терапію, і не було зафіксовано жодних значущих патологічних результатів, що свідчить про відсутність шкідливих наслідків порівняно з контрольними мишами.

Системна доставка AAV комбінованої генної терапії змінює симптоми діабету для мишей на HFD. (A) GTT мишей голодували протягом ночі протягом 8 год. Глюкоза в крові вимірюється через 0, 15, 30, 60 та 120 хв після перорального введення 50 мг глюкози. (B) Площа під кривою (AUC) GTT. (C) ІТТ мишей голодували протягом 6 год. Глюкоза в крові вимірюється через 0, 15, 30, 60 та 120 хв після підшкірної ін’єкції 0,5 МО/кг інсуліну. (D) AUC ITT. (E) HOMA-IR. (F) HOMA-β. (G) Вимірювання інсуліну натще у мишей, які голодували протягом 8 годин протягом ночі перед GTT. n = 10 для мишей AAV: GFP ND та n = 12 для мишей AAV: GFP та AAV: FFF21 HFD. Статистичні тести в B та D – G є односторонніми ANOVA. Смужки помилок представляють SEM. С, контроль; F, FGF21; K, αKlotho; Т, sTGFβR2; TF, sTGFβR2 + FGF21; TFK, sTGFβR2 + FGF21 + αKlotho; TK, sTGFβR2 + αKlotho; FK, FGF21 + αKlotho. * P † P ⇓ ⇓ –43). Третя модель захворювання, що застосовується для оцінки одноразової та комбінованої терапії, використовувала односторонню обструкцію сечоводу (UUO), усталений спосіб моделювання прогресуючого фіброзу нирок, що є особливістю ниркової хвороби (44). Ми вводили мишам одноразові та комбіновані генні терапії за 1 тиждень до індукції захворювання за допомогою UUO, а нирки збирали та аналізували на фіброз та реконструювали 1 тиждень після процедури UUO. Зображення цілих нирок, пофарбовані трихромовою плямою Массона (MTS), показали, що надмірна експресія αKlotho змогла запобігти погіршенню стану ниркового мозку та витонченню кори нирок порівняно з контролем (рис. 3 А і В). Дивно, але найбільше пом'якшення медулярної атрофії відбулося завдяки поєднанню AAV: sTGFβR2 та AAV: FGF21, яке значно ефективніше, ніж AAV: αKlotho, у запобіганні нирковій медулярній атрофії, лише 6,4% атрофії порівняно з 22,5% відповідно (P † P

Методи

Вектор будівництва.

Номери приєднання Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) для FGF21, αKlotho та TGFβR2 складають 56636, 16591 та 21813 відповідно.

Виробництво вірусів.

AAV був створений за допомогою потрійної трансфекції клітин HEK293T та очищення градієнта йодиксанолу, як описано раніше. Коротко кажучи, клітини HEK293T трансфікували за допомогою PEI max (1 мг/мл) при співвідношенні 4: 1 до ДНК. Хелперну плазміду, капсид та ген, що нас цікавить (інвертована термінальна повторна плазміда) трансфікували при молярному співвідношенні 2: 1: 1. Носії та клітини збирали через 72 год після трансфекції. Клітини лізували 3-разовим заморожуванням-відтаванням, обробляли бензоназою протягом 45 хв, центрифугували для видалення клітинного сміття перед об'єднанням із середовищем та фільтрували через 0,2-мкм фільтр; 40% поліетиленгліколю 8000 додавали до кінцевої концентрації 8%. Вірус, що містить носій, перемішували протягом 1 години при 4 ° С, а потім залишали на ніч. Потім середовище обертали при 3000 × g протягом 20 хв і супернатант відкидали. Осад ресуспендували в 5 мл 1-разового сольового розчину, забуференного фосфатом (PBS), і підкладали градієнтом йодиксанолу (15, 25, 40 та 60%) в пробірки для ущільнення (BECKMAN COULTER). Потім його ультрацентрифугували при 250000 × g протягом 1 год у BECKMAN COULTER VTi50. Фракцію 40% збирали і промивали 5 разів 1 × PBS, що містить 0,001% PLURONIC F65 (SIGMA), і зберігали в 1 × PBS з 5% сорбітом і 0,001% PLURONIC F65 при -80 ° C.

qPCR, ІФА, західне фарбування та імуно забарвлення.

Вірус титулювали за допомогою qPCR за допомогою TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) для загальної 3 ′ області всіх векторів у WPRE3 (посттранскрипційний регулятивний елемент woodchuck): прямий праймер: 5′-CTTCCCGTATGGCTTTCATTTT, зворотний праймер: 5′-GCCGTGACCACAA, і зонд: 5′-FAM-TCCTCCTT-ZEN-GTATAAATC-IBFQ (спеціальний зонд IDT). ІФА проводили для мишей TGFb1 та FGF21 миші (ABCAM ab119557; ab212160). Антитілом, що використовується для αKlotho, є AF1819 від R&D SYSTEMS. αSMA фарбували за допомогою ab5694 від ABCAM. Аглютинін зародків пшениці (WGA) був від ABCAM 20528, а DAPI - від SIGMA. Зразки фіксували формаліном протягом 24 годин, а потім вносили парафін.

OGTT, ITT та PTT.

Всім мишам було проведено терапію AAV або контрольний вірус за 30 днів до тестування цих параметрів, і вони знаходились на HFD протягом від 4 до 5 місяців. Миші голодували протягом ночі протягом 8 год для перорального тесту на толерантність до глюкози (OGTT) та тесту на толерантність до пірувату (PTT). Миші голодували лише 6 год для тесту на толерантність до інсуліну (ITT). Вони виконувались, як описано раніше. Коротко, після голодування було виміряно початковий рівень глюкози в крові; перорально вводили болюс 500 мг глюкози для ОГТТ, вводили дозу пірувату 2 г/кг внутрішньочеревно або вводили дозу інсуліну 0,5 МО/кг внутрішньочеревно. Глюкозу в крові вимірювали з інтервалом 15-, 30-, 60- та 120-хвилин. Мишам, які перебували на НД, вводили дозу 1 МО/кг інсуліну. Побачивши, що через 30 хв у всіх мишей FGF21 глюкоза падає нижче 40 мг/дл, решті мишей HFD вводили нижчу дозу 0,5 МО/кг. Використовували монітор глюкози One Touch Ultra та чорні смужки.

Мишей поміщали на нагрівальні прокладки з контролем температури, підтримувані при 37 ° С. Мишей розміщували з повністю витягнутою головою та шиєю, щоб забезпечити відкриті дихальні шляхи. Температуру мишей та термопрокладки контролювали при 37 ° C за допомогою ректального зонда, який контролює температуру тіла протягом процедури. UUO було досягнуто оголенням лівої нирки через лівий фланг. Біля ниркової миски повністю заблоковано сечовід за допомогою 4-0 шовкового плетеного поліефірного краватки Ethibond у 2 точках. Шкіру скріплювали за допомогою стерильних скоб. Шви не використовували. Потім мишей евтаназували через 7 або 14 днів після операції, а тканини та кров збирали для аналізу. Мишей рандомізували і засліплювали хірургів таким чином, що вони не знали, які миші отримували яку терапію.

ECHO.

Їх виконували, як описано раніше в «Трансторакальній ехокардіографії на мишах», проведеною Респрессом та Веренсом (52). Коротко кажучи, мишей знеболювали та горіли. Потім розігрітий ультразвуковий гель наносили на грудну клітку над серцем і робили знімки. Мишей рандомізували та осліплювали з боку техніків, так що вони не знали, які миші отримували яку терапію.

Кількісна оцінка зображень.

Зображення цілих органів були зроблені в 10 разів, зшиті за допомогою програмного забезпечення Zen Zeiss та проаналізовані за допомогою спеціального програмного забезпечення MATLAB. Програмне забезпечення MATLAB використовувало інструмент обмеження кольорів, щоб спочатку вибрати цікаві кольори пікселів, а потім експортувати їх як код, який можна використовувати як виклик функції для всіх наступних зображень. Сценарій зберігав кількість пікселів та експортував їх як текстовий файл. Співвідношення обчислювали простим діленням плями зацікавлених та загальної площі органу. Загальну площу органу отримували шляхом встановлення порогових значень для всіх кольорів на тлі білого фону, що оточував орган.