Нейрони AgRP можуть збільшити споживання їжі в умовах придушення апетиту та інгібувати анорексигенні парабрахіальні нейрони

Анотація

ЗАЯВА ПРО ЗНАЧЕННЯ Мотивація прийому їжі залежить від відносного балансу активності в окремих регіонах мозку, які викликають або пригнічують апетит. Ненормальна кількість активності в нейронах, що викликають апетит, може спричинити ожиріння, тоді як ненормальна кількість активності в нейронах, що пригнічують апетит, може спричинити гіпотрофію та значне зниження маси тіла. Метою цього дослідження було визначити, чи може популяція нейронів, що викликають апетит ("нейрони AgRP"), спонукати споживання їжі для подолання придушення апетиту після введення різних сполучних речовин, що пригнічують апетит. Ми виявили, що стимулюючі нейрони AgRP можуть подолати різні форми придушення апетиту та зменшити нервову активність в окремій сукупності нейронів, що пригнічують апетит, надаючи нові уявлення про те, як мозок регулює споживання їжі.

AgRP
апетит
CGRP
ChR2
прийом їжі
парабрахіальне ядро

Вступ

Мотивація прийому їжі залежить від відносного балансу активності між орексигенною та анорексигенною системами мозку (Sternson and Eiselt, 2017). Нейрони, що експресують пов'язаний з Агуті (AgRP), в дугоподібному ядрі гіпоталамуса є ключовою популяцією орексигенних нейронів, яка збільшує поведінку споживання їжі у відповідь на гомеостатичну потребу (Ільницька та Аргіропулос, 2008; Стернсон, 2013). Ці нейрони також експресують нейропептид Y та гальмівний нейромедіатор GABA (Tong et al., 2008; Wu et al., 2009). Нейрони AgRP підвищують активність у відповідь на депривацію їжі та введення орексигенного гормону греліну, як це продемонстровано експресією Fos (непрямий маркер нейрональної активності), електрофізіологічним записом на зрізах мозку та візуалізацією кальцію in vivo (Takahashi and Cone, 2005; Betley et al., 2015; Chen et al., 2015; Mandelblat-Cerf et al., 2015). Крім того, нейрони AgRP є як необхідними, так і достатніми для опосередкування поведінки при харчуванні: хемогенетичне інгібування нейронів AgRP значно зменшує годування (Krashes et al., 2011), а генетична абляція нейронів AgRP викликає голод (Luquet et al., 2005); навпаки, оптогенетична або хемогенетична стимуляція нейронів AgRP спричиняє швидке та оборотне збільшення споживання їжі (Aponte et al., 2011; Krashes et al., 2011).

Щоб організувати поведінку при вживанні їжі, нейрони AgRP проектують декілька надлишкових популяцій нейронів, розташованих нижче за течією (Betley et al., 2013). Щоб максимально сприяти вживанню їжі, нейрони AgRP можуть одночасно інгібувати інші системи мозку, які активно пригнічують апетит. Наприклад, стимуляція нейронів AgRP може інгібувати анорексигенні нейрони в ядрі паравентрикулярного таламуса, побічно відновлюючи подібні до голоду схеми реакції в корі острова після їжі (Livneh et al., 2017).

Нейрони AgRP можуть також прямо чи опосередковано інгібувати анорексигенні нейрони в парабрахіальному ядрі (PBN), які експресують пептид, пов'язаний з геном кальцитоніну (CGRP), і, як було показано, пригнічують апетит (Carter et al., 2013). Ці нейрони підвищують активність у відповідь на анорексигенні сигнали, такі як амілін та холецистокінін (CCK), гормони, що виділяються після їжі підшлунковою залозою та тонкою кишкою відповідно (Becskei et al., 2007; Carter et al., 2013). Нейрони PBN CGRP також посилюють експресію Fos після прийому екзогенних засобів, що пригнічують апетит, таких як хлорид літію (LiCl), сіль, яка створює шлунковий дискомфорт, та ліпополісахарид (LPS), компонент клітинної стінки бактерій, що викликає запалення (Rinaman and Dzmura, 2007; та ін., 2013, 2015). Оптогенетична або хемогенетична стимуляція нейронів PBN CGRP швидко і оборотно зменшує споживання їжі (Carter et al., 2013; Campos et al., 2016). Під час базових умов хіміогенетична інактивація нейронів PBN CGRP збільшує розмір їжі та тривалість, але не впливає на загальне споживання їжі з часом (Campos et al., 2016). Навпаки, під час пригнічення апетиту хіміогенетична інактивація нейронів PBN CGRP збільшує загальне споживання їжі (Carter et al., 2013; Campos et al., 2016). Постійна інактивація нейронів PGR CGRP через правцевий токсин повністю усуває насичувальний ефект CCK (Campos et al., 2016).

Нейрони AgRP посилають GABAergic проекції на PBN (Wu et al., 2009; Atasoy et al., 2012; Betley et al., 2013; Campos et al., 2016), припускаючи, що нейрони AgRP можуть прямо або опосередковано інгібувати нейрони CGRP PBN. . Відповідно до цієї гіпотези, нейрони CGRP є високоактивними після абляції нейрону AgRP (Wu et al., 2009; Campos et al., 2016), а стимулювання проекцій AgRP до PBN зменшує експресію Fos у нейронах PBN CGRP після введення анорексигенний гормон екзендін-4 (Campos et al., 2016).

Ми перевірили гіпотези, згідно з якими нейрони AgRP можуть подолати придушення апетиту після введення анорексигенних сполук та зменшити активність нейронів PBN CGRP. Ми виявили, що стимуляція нейронів AgRP або прогнозування нейрону AgRP до PBN збільшує споживання їжі після введення аміліну, CCK та LiCl, але не LPS. Стимуляція нейронів AgRP покращила придушення апетиту, спричинену хемогенетичною стимуляцією нейронів PBN CGRP, та зменшила експресію Fos у нейронах PBN CGRP за будь-яких умов. Наші висновки показують, що нейрони AgRP можуть подолати пригнічення апетиту на основі запалення та знизити активність в анорексигенних нейронах PBN CGRP, з’ясовуючи, як мозок балансує орексигенні та анорексигенні вхідні дані для регулювання поведінки годування.

Матеріали і методи

Усі експерименти були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин в Уїльямс-коледжі та проводились відповідно до керівних принципів, описаних у Керівництві Національного інституту охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин. Ми використовували самців мишей AgRP Cre/+ (Tong et al., 2008; Jackson Laboratories, Catalogue # 012899), виведених на фоні C57BL/6. У деяких експериментах ми схрещували мишей AgRP Cre/Cre з мишами Calca Cre/+ (Carter et al., 2013), щоб отримати мишей AgRP Cre/+; Calca Cre/+. На момент операції всім мишам було 7–9 тижнів у віці та не більше 16–20 тижнів на момент припинення експериментів. Мишей утримували в окремих клітках з 12-годинним циклом світло/темрява при 22 ° C.

Підготовка вірусу.

Cre-індуковані рекомбінантні аденоасоційовані аденоасоційовані віруси серотипу 1 (AAV1), що несуть або трансгенні ChR2-mCherry (AV-1-20297P), eGFP (AV-1-ALL854), або TdTomato (AV-1-ALL864), отримані з Ядро вектора університету Пенсільванії. Cre-індуковані вектори AAV8, що містять або hM3Dq-mCherry (44361), або mCherry (50459), були отримані від Addgene. Вірусні аликвоти зберігали при -80 ° C до стереотаксичної ін'єкції.

Стереотаксична хірургія.

Мишей знеболювали 4% ізофлураном і поміщали на стереотаксичну рамку (David Kopf Instruments). Потрапляючи на каркас та протягом решти хірургічних процедур, миші отримували 1–2% ізофлурану через нос. Після того, як череп був виставлений і вирівняний в горизонтальній площині, AAV вводили стереотаксично одно- або двосторонньо, як описано в тексті, в дугоподібне ядро [Рис. 1А; передньозадній (AP), -1,4 мм; посередньобічний (ML), 0,45 мм; дорсовентральний (ДВ), -5,9 мм]. У деяких експериментах AAV також вводили стереотаксично в парабрахіальне ядро (AP, -4,9 мм; ML, 1,4 мм; DV, 3,8 мм). Загалом 0,5 мкл вірусу вводили зі швидкістю 0,1 мкл/хв і давали 8–10 хв дифундувати, перш ніж ін’єкційну голку видалити.

Після вірусної ін’єкції мишам було проведено односторонню хірургічну імплантацію моноволоконно-оптичної канюлі (доричні лінзи) над дугоподібним ядром (рис. 1А; AP, -1,4 мм; ML, 0,45 мм; DV 5,5 мм). У подальших експериментах мишам отримували односторонню або двосторонню хірургічну імплантацію волоконно-оптичних канюль над PBN (AP, -5,2 мм; ML, 1,6 мм; DV, 3,0 мм). Канюлі фіксували на черепі за допомогою C&B Metabond (Parkell) та зубного акрилу. Всім мишам забезпечували щонайменше 14 днів для відновлення після операції перед початком експериментальних процедур. Після поведінкових експериментів відділи мозку, що містять дугоподібне ядро, перевіряли на предмет експресії вірусу та правильної імплантації волоконно-оптичних канюль (рис. 1B, C); тварини, які не виявляли вірусної експресії (флуоресценція mCherry або GFP) або належного розміщення канюль, не були включені в подальший аналіз даних.

Вимірювання споживання їжі.

Для аналізів годівлі мишей окремо розміщували в клітках для вимірювання споживання їжі/рідини, прикріплених до пляшок з водою, встановлених на вагах (Omnitech Electronics). Мишам забезпечували рідку дієту Vanilla Ensure (Abbott Nutrition), розведену у співвідношенні 1: 2 з водою. Ця рідка дієта мала щільність калорій 450 ккал/л. Мишам дозволяли звикати мінімум 72 години. Пляшки, що містять рідку дієту, мили та дезінфікували щодня і повністю поповнювали їх на початку світлового циклу. Оскільки миші, як правило, збільшували споживання їжі у відповідь на поповнення рідкої дієти, випробування на вживання їжі проводили принаймні через 3 години після обміну пляшечок зі свіжими продуктами. Всі вимірювання споживання їжі були отримані протягом середини 4 год неактивного циклу (4–7 год після настання світла).

Фотостимуляція.

Мишей прикріплювали до волоконно-оптичних кабелів (довжиною 1,5 м, діаметром 200 мкм; доричні лінзи), покритих непрозорою термоусадочною трубою, і перед експериментальними сеансами давали можливість кліматизуватися щонайменше 5 днів. Фотостимуляцію виробляв 473 нм лазер синього світла (LaserGlow), керований імпульсним стимулятором Master-8 (AMPI), який був запрограмований на подачу імпульсів світла 10 мс при 20 Гц протягом 1 с кожні 4 с протягом 20 хв (рис. 1D). Для кожного дослідження споживання їжі реєстрували рівно за 1 год: 20 хв до, під час та після фотостимуляції (рис. 1D).

Фармакологія.

Всі анорексигенні сполуки готували в 0,9% стерильному фізіологічному розчині та зберігали при -20 ° C перед використанням. Для кожного випробування на прийом їжі 250 мкл 0,9% стерильного фізіологічного розчину, аміліну (10 мкг/кг; Bachem), CCK (10 мкг/кг; Bachem), LiCl (84 мг/кг; Bachem) або LPS (50 мкг/кг; Calbiochem), вводили внутрішньочеревно. Для швидкодіючих сполук (амілін, CCK, LiCl) та фізіологічного розчину ін’єкції виконували за 10 хв до реєстрації прийому їжі (за 30 хв до оптогенетичної стимуляції; рис. 1Е). Оскільки ЛПС не пригнічує апетит відразу, а навпаки, зменшує апетит через ініціювання запальної реакції, ін’єкції ЛПС виконували за 4 год до запису прийому їжі (рис. 1Е). Всі випробування на прийом їжі проводили протягом середини 4 год неактивного періоду. Мишам давали можливість принаймні за 24 години відновитись після ін’єкції аміліну, CCK та LiCl до початку наступних випробувань та щонайменше за 48 годин для відновлення після ін’єкції LPS для врахування додаткового часу відновлення через запальну реакцію. На кожній миші проводили максимум вісім випробувань на сполуку.

Для фармакогенетичних експериментів мишам вводили внутрішньочеревно ін’єкцію клозапін-N-оксиду (CNO; 0,5 мг/кг, Sigma-Aldrich) за 2 год до вимірювання споживання їжі. Мишам дозволяли принаймні 48 год відновитися між випробуваннями.

Гістологія.

В кінці експериментальних процедур мишам знеболювали внутрішньочеревно ін'єкцією 2,2,2 трибромметанолу (Sigma-Aldrich, 48402), розчиненого в трет-аміловому спирті та стерильному 0,9% фізіологічному розчині. Потім мишей перкардировали перфузією холодного 0,01 м PBS, рН 7,4, а потім 4% параформальдегіду в PBS. Мозок екстрагували, давали постфіксуватися протягом ночі в 4% параформальдегіді при 4 ° C і кріозахищали у 30% сахарозі, розчиненій у PBS, протягом додаткових 24 годин при 4 ° C. Кожен мозок розділяли на мікротомі (Leica Microsystems) із розміром 30 мкм і збирали в холодному PBS.

Для експериментів з імуногістохімії зрізи тричі промивали в PBS 0,2% Triton X-100 (PBST) протягом 10 хв при кімнатній температурі. Потім зрізи інкубували в блокувальному розчині, складеному з PBST, із 3% нормальною ослиною сироваткою (Jackson ImmunoResearch, 017-000-121) протягом 15 хв при кімнатній температурі. Для первинного впливу антитіл зрізи інкубували у кролячих анти-Fos (1: 1000; Cell Signaling Technology, 2250) у блокуючому розчині протягом ночі при 4 ° C. Після трьох 5-хвилинних промивань у блокувальному розчині зрізи інкубували в ослиному анти-кролику AlexaFluor 488 (1: 250; Jackson ImmunoResearch, 711-545-152) у блочному розчині протягом 1 години при кімнатній температурі. Нарешті, зрізи тричі промивали в PBS.

Мозкові зрізи монтували в PBS на скляні предметні стекла SuperFrost Plus (VWR, 48311-703), покривали Dapi Fluoromount-G (Southern Biotech, 0100-20) і зберігали в темряві при 4 ° C перед мікроскопією та візуалізацією. Слайди знімали за допомогою епіфлуоресцентного мікроскопа Eclipse 80i (Nikon), а зображення знімали за допомогою цифрової камери RETIGNA 2000R. Отримані зображення були мінімально оброблені за допомогою Photoshop CS5 (Adobe Systems) для підвищення яскравості та контрасту для оптимального подання даних. Всі цифрові зображення оброблялись однаково між експериментальними умовами, щоб уникнути штучних маніпуляцій між різними наборами даних.

Кількісне визначення колокалізації Fos і mCherry в PBN проводили на сусідніх ділянках від ∼-4,90 до -5,50 мм від брегми (21 секція на мишу). Весь кількісний аналіз проводився дослідником, засліпленим ідентичністю умов, що використовуються для індукування Фос.

Експериментальне проектування та статистичний аналіз.

Ми використовували експериментальну конструкцію між суб’єктами для всіх експериментів, за винятком тих, що виконувались на малюнку 3, в якій ми використовували внутрішньодисциплінарну конструкцію (порівняння ad libitum та умов позбавлення їжі у тварин). Усі поведінкові експерименти включали n ≥ 5 для кожної когорти тварин з принаймні п’ятьма випробуваннями для кожної тварини. Всі експерименти експресії Фоса включали n = 5 для кожної когорти тварин з одним випробуванням для кожної тварини. Дані аналізували за допомогою Prism 6.0 (програмне забезпечення GraphPad). Статистичні тести включали двосторонній ANOVA з повторними вимірами (рис. 2, 3, 4D – F, 6B – G, I), двосторонній ANOVA без повторних вимірювань (рис. 5) та непарний двосторонній t-тест, як описано в тексті.

Результати

Оптогенетична стимуляція нейронів AgRP індукує годування після введення незапальних анорексигенних сполук

Оптогенетичні та фармакологічні парадигми, що використовуються для маніпулювання поведінкою годування. A, Діаграма, що показує розміщення моноволоконно-оптичної канюлі над дугоподібним ядром та конструкцій AAV, що використовуються для трансдукції нейронів AgRP. Сірий та чорний трикутники представляють місця loxP та lox2722 відповідно. B, C., Репрезентативні зображення, що демонструють односторонню експресію ChR2-mCherry (B) або GFP (C.) в дугоподібному ядрі. Пунктирна лінія показує приблизне розташування наконечників волоконно-оптичних імплантатів. Шкала шкали, 250 мкм. D, Протокол фотостимуляції. Протягом 20 хв періоду фотостимуляції імпульси світла 10 мс подавали з частотою 20 Гц протягом 1 с кожні 4 с. Е, Графік ін’єкцій для експериментів з прийомом їжі.

Модель функціональної анатомії проекцій нейрону AgRP. Нейрони AgRP збільшують споживання їжі, проектуючи на нижчі за течією популяції (зелені сполуки), які ініціюють живлення, включаючи ядро ложа stria terminalis (BNST), латеральний гіпоталамус (LH), ядро паравентрикулярного гіпоталамусу (PVH) і ядро паралатричного таламусу (PVT). Нейрони AgRP також інгібують інші поведінкові/фізіологічні стани, що не годуються, проектуючи на нижчі ділянки (червоні сполуки), такі як MeA, щоб пригнічувати страх і агресію, або дугоподібні нейспени кисспептину (Kiss), щоб пригнічувати розмноження. Наші результати демонструють, що нейрони AgRP роз'єднують не запальні стани, що пригнічують апетит, проектуючи на PBN (темно-червоні з'єднання).

Виноски

Цю роботу підтримав Національний інститут охорони здоров'я грант DK105510 від Національного інституту травлення та діабету та хвороб нирок (NIDDK) до M.E.C. Ми вдячні Р. Пальмітеру за мишей Calca Cre та Н. Гольдштейну, Б. Леваїну та К. Муку за конструктивні коментарі та відгуки щодо статті.

Автори заявляють про відсутність конкуруючих фінансових інтересів.