Надмірна вага у мишей та посилений адипогенез in vitro пов’язані з відсутністю їжака-корецептора Boc

H.-J.L. та S.-B.J. внесли однаковий внесок у цю роботу.

Анотація

Вступ

Поширеність ожиріння та супутніх метаболічних патологій привернула увагу до виявлення етіологічних факторів (1,2). Ожиріння виникає через генетичні, екологічні та поведінкові фактори, що впливають на енергетичний баланс. Основною особливістю ожиріння є надмірне накопичення білої жирової тканини (WAT) (1,3–5). Хоча ожиріння розуміється як централізовано регульований наслідок переїдання та/або зменшення витрат енергії, процеси, що регулюють розширення ВАТ на рівні адипоцитів, недостатньо охарактеризовані.

Розширення ВАТ відбувається за рахунок гіпертрофії адипоцитів та гіперплазії, тому такі процеси, ймовірно, на певному рівні втягують процес адипогенезу (3,4). Адипогенез аналізували за допомогою клітинних ліній преадипоцитів, таких як 3T3-L1, та різних мутантних ліній миші (6). Ці дослідження з'ясували транскрипційну мережу, зосереджену навколо членів сімейства PPARγ та C/EBP, які зумовлюють диференціацію преадипоцитів у адипоцити, що накопичують ліпіди (6). Недавні дослідження виявили клітини стромальної судинної фракції (SVF) WAT, які є добросовісними клітинами-попередниками адипоцитів (7,8). Такі клітини у ВАТ повинні реагувати на гормональні та місцеві сигнали, які регулюють гомеостатичне підтримання цієї тканини. Сигнали, що діють на клітини-попередники адипоцитів, недостатньо зрозумілі, але серед задіяних є сигнальний шлях Їжака (HH).

Білки HH регулюють події розвитку в організмах настільки різноманітно, як комахи та ссавці. Серед білків HH ссавців Sonic Hedgehog (SHH) відіграє найширшу роль і бере участь у зростанні та/або морфогенезі багатьох структур тіла (9). Білки HH активують збережений шлях передачі сигналу (10–12). За відсутності ліганду первинний рецептор HH PTCH1 функціонує, щоб інгібувати передачу сигналів другим мембранним білком, SMO. Зв'язування HH з PTCH1 полегшує інгібування SMO та SMO-сигналів для активації генів-мішеней шляху через фактори транскрипції GLI. Серед таких цільових генів є самі Gli1 та Ptch1, і вони часто використовуються як зчитування активності шляху (10–12).

CDO (також званий CDON), BOC та GAS1 є білками клітинної поверхні, які сприяють активності шляху HH як ліганд-зв'язуючих корецепторів з PTCH1 (13–20). CDO та BOC є спорідненими трансмембранними білками (21,22), тоді як GAS1 - це прикріплений до GPI білок, не пов'язаний з CDO та BOC (23). Аналіз мишей з цільовими мутаціями в Cdon, Boc та Gas1 показав, що, хоча жодна з них не є важливою для активності шляху HH, вони в сукупності необхідні для функціонування шляху в ранньому ембріоні миші (13,14,16,19). Потрійний комплекс ліганду HH, PTCH1 і, принаймні, один з цих корецепторів, здається, необхідний для успішної передачі сигналу (15,16,24). Бок-нульові миші, які були предметом цього дослідження, є життєздатними та родючими, але виявляють дефекти в залежності від SHH нейронного візерунка та наведення аксонів (19,25–28).

Шлях HH негативно регулює адипогенез. Активація шляху HH за допомогою SHH або SMO-агоніста пурморфаміну пригнічувала адипогенез 3T3-L1 та додаткові клітинні лінії (29–32). Крім того, блокада передачі сигналів HH, з домінантно-негативною формою GLI2 або антагоністом SMO циклопаміном, посилювала адипогенез цих клітин у відповідь на індукуючі фактори (31,32). Сигнали HH блокували ранні етапи адипогенезу, вище за течією експресії PPARγ (29,31,32). Ці дослідження показують, що шлях HH функціонує для блокування диференціації преадипоцитів in vitro. Експерименти на мишах узгоджуються з цим поняттям. Дорослі миші, гомозиготні за гіпоморфним алелем Ptch1, продемонстрували знижену масу ВАТ, яка мала нижчий рівень жирових маркерів та підвищений рівень цільових генів HH (33). Мутація, характерна для жирової тканини, іншого інгібітора шляху HH, Суфу, призвела до втрати ВАТ (34). Нарешті, миші з індукованим дієтою або генетичним (ob/ob) ожирінням демонстрували знижену експресію компонентів шляху HH (31).

Незважаючи на те, що миші з генетичним коефіцієнтом посилення функції в активності шляху HH продемонстрували втрату WAT (33,34), не було продемонстровано, що миші з втратою активності HH посилювали ожиріння. Ми повідомляємо, що миші з мутацією зародкової лінії у Boc демонструють залежність від віку надмірної ваги через збільшення WAT. Ці миші також виявляють завищену реакцію на дієту з високим вмістом жиру (HFD), а Boc -/- фібробласти ембріонів диференціюються в адипоцити ефективніше, ніж клітини дикого типу. Ці результати показують, що BOC, який, мабуть, діє як корецептор SHH, необхідний для підтримки нормальної ваги in vivo та належного регулювання адипогенної диференціації in vitro.

Дизайн та методи дослідження

Для оцінки метаболічних параметрів (рис. 2) 5-місячних мишей Boc +/+ та Boc -/- аналізували за допомогою метаболічних клітин (Гарвардський апарат; Panlab). Вимірювання проводили протягом 48 год, протягом яких тварини мали доступ до їжі та води. Температуру тіла в основному вимірювали за допомогою гомеотермічного ковдри/прокладки HB-101 (Гарвардський апарат).

Гістологія, фарбування маслом червоного кольору O та фарбування плацентарної лужної фосфатази

Для фарбування гематоксилін-еозином (H-E) WAT і тканини печінки фіксували та обробляли для парафінових зрізів 20 мкм. Для фарбування Oil Red O печінки фіксували у 4% PFA та зневоднювали градієнтом сахарози з подальшим оптимальним різанням сполуки - кріосекція (10 мкм) та фарбуванням Oil Red O. Для фарбування олійно-червоним O диференційованих мишачих ембріональних фібробластів (MEF) та клітин 3T3-L1 культури фіксували у 10% формальдегіді протягом 10 хв і фарбували олійним червоним O. Пофарбовані пластинки обробляли 1 мл ізопропанолу/4% NP-40 протягом 10 хв легким струшуванням, і екстрагований Олійно-червоний О визначали кількісно, вимірюючи оптичну щільність при 520 нм. Для фарбування плацентарної лужної фосфатази (PLAP) тканини фіксували 2% PFA плюс 0,2% глутаральдегіду протягом 2 год при 4 ° C, промивали PBS, проникали в 0,3% Triton протягом ночі при 4 ° C, промивали сольовим розчином, інактивували тепло 30 хв при 72 ° С, промивають NTM (100 ммоль/л NaCl, 100 ммоль/л трис-HCl, рН 9,5, 50 ммоль/л MgCl2), і фарбують BM фіолетовим (Roche).

Клітинні культури

Підготовка SVF з WAT проводилася, як описано раніше (8). Коротше кажучи, WAT подрібнювали ножицями і розщеплювали 2 мг/мл колагенази I (Sigma-Aldrich) в DMEM при 37 ° C протягом 1 години. DMEM плюс 10% FBS додавали для подвоєння обсягу, плаваючі адипоцити видаляли і дайджест фільтрували через 100-мкм сітку, яка утримувала судини фракції стромальних частинок. Фільтрат центрифугували при 800g протягом 5 хв, а гранулу SVF ресуспендували в DMEM, що містить 10% FBS, і культивували протягом 2 днів.

Виділення первинних MEF проводили, як описано раніше (35). Клітини 3T3-L1 та MEF культивували в середовищі для зростання (DMEM плюс 10% FBS) при субконфлюенции. Для диференціації адипоцитів клітини вирощували до місця злиття і переводили в середовище диференціювання I (середовище росту плюс 0,5 мкмоль/л IBMX, 1 мкг/мкл інсуліну, 0,25 мкмоль/л дексаметазону, 2 мкмоль/л розиглітазону; Sigma-Aldrich) протягом 2 днів . Потім живильне середовище змінювали на середовище диференціювання II (середовище росту плюс 2 мкмоль/л розиглітазону), а середовище змінювали кожні 2 дні. Щоб активувати передачу сигналів SHH, MEF обробляли 250 нг/мл SHH (R&D Systems) або 5,2 мкмоль/л пурморфаміну (Calbiochem) у середовищі для диференціації з дня диференціації на наступний день.

Імуноблотинг

Імуноблотинг проводили, як описано раніше (15). Використані антитіла наведені в таблиці 1.

Антитіла, використані в цьому дослідженні

ПЛР та кількісний аналіз РТ-ПЛР

Тканини гомогенізували FastPrep-24 (MP Biomedicals) і екстрагували набором для екстракції РНК (iNtRON). кДНК генерували за допомогою PrimeScript RT Reagent Kit (Takara) та ампліфікували полімеразою nTaq (Enzynomics). Кількісну RT-PCR (qRT-PCR) проводили за допомогою SYBR Green (Takara) та аналізували за допомогою системи TP8000 (Takara). Усі дані нормалізовані до експресії L32, що кодує білок рибосом. Праймери, використані в цьому дослідженні, наведені в таблиці 2.

Послідовності праймерів, використані в цьому дослідженні

Візуалізація

Мікроскопію проводили на Nikon ECLIPSE TE2000-U з програмним забезпеченням NIS-Elements F (Nikon), Zeiss AxioPlan 2 та Zeiss AxioPlan 2 IE. Відстежували адипоцити та вимірювали їх площу за допомогою програмного забезпечення ImageJ.

Статистичний аналіз

Вікова надмірна вага у мишей Boc -/-. В: Часовий курс маси тіла у мишей Boc +/+ (+/+) та Boc -/- (-/-). Значення є середніми ± SEM; n = 31–42 для мишей Boc +/+ та n = 25–43 для мишей Boc -/- у різні моменти часу. * P +/+ і Boc -/- миші. Зверніть увагу, що Boc -/- BAT блідіший, ніж у контрольного, і має зони очевидного відбілювання (стрілки). E: H-E-пофарбовані ділянки BAT від мишей Boc +/+ та Boc -/-. Брусок, 50 мкм. F: H-E-пофарбовані ділянки WAT від мишей Boc +/+ та Boc -/-. Брусок, 50 мкм. G: Середня площа адипоцитів із зрізів дорослого ВАТ від +/+ та -/- мишей. Значення є середніми ± SD; n = 3. H: Розподіл ділянок адипоцитів за зрізами дорослого WAT від мишей +/+ та -/-. Значення є середніми ± SD; n = 3. I: Споживання їжі 24-тижневими мишами +/+ та -/-. BW, маса тіла. Значення є середніми ± SD; n = 7.

Оскільки миші Boc -/- не були гіперфагічними, ми оцінили, чи сприяло зменшення витрат енергії їх збільшенню ожиріння. Для оцінки швидкості метаболізму у всьому тілі використовували нормальних 5-місячних мишей Boc +/+ та Boc -/-, яких годували чау (Рис. 2А). Миші Boc -/- демонстрували дещо нижчу температуру тіла, ніж миші Boc +/+ (рис. 2B). Спонтанна локомотивна активність у мишей Boc -/- становила в середньому приблизно вдвічі менше, ніж у контрольних мишей, але ця різниця не була статистично значущою, і не було різниці в активності вирощування (рис. 2C і D). Миші Boc -/- демонстрували дещо знижене споживання кисню та вироблення вуглекислого газу під час світлової фази (рис. 2E та F). Коефіцієнт дихання був трохи нижчим у мишей Boc -/- як у темній, так і у світлій фазах, але знаходився в межах норми (рис. 2G). Витрати енергії мишами Boc -/- також незначно зменшились під час світлової фази (рис. 2Н), але загальні витрати енергії (темний плюс світло) не відрізнялися. Ці результати свідчать про те, що миші Boc -/- мають зміни в метаболізмі всього тіла, що може сприяти надмірній вазі.

Погіршення фенотипів печінки та WAT у мишей Boc -/- на HFD. В: Зрізи печінки, забруднені олійною червоною фарбою, та ділянки WAT, пофарбовані H-E від мишей Boc +/+ та Boc -/- на HFD. Брусок, 50 мкм. B: Середня площа адипоцитів із зрізів дорослого WAT від мишей Boc +/+ та Boc -/-. Значення є середніми ± SD; n = 3. * P +/+ і Boc -/- миші на HFD. Значення - це засоби відносного рівня вираження ± SD; n = 3. *** P +/+ і Boc -/- миші на HFD. Значення - це засоби відносного рівня вираження ± SD; n = 3. *** P +/+ і Boc -/- миші на HFD. F: qRT-ПЛР-аналіз експресії адипогенного, ліпідного обміну та адипокінових генів у WAT мишей Boc +/+ та Boc -/- на HFD. Значення - це засоби відносного рівня вираженості ± SD; n = 3. *** P +/+ і Boc -/- миші на HFD. H: qRT-ПЛР-аналіз експресії роз'єднуючих білків у BAT мишей Boc +/+ та Boc -/- на HFD. Значення - це засоби відносного рівня вираженості ± SD; n = 3. * P -/- MEF

Аналіз експресії Boc. В: qRT-ПЛР-аналіз експресії Boc в різних тканинах дорослої людини. Значення - це засоби відносного рівня вираження ± SD; n = 3. Експресія L32 встановлена як 1. B: Фарбування лужної фосфатази WAT від мишей Boc +/+ і Boc +/− (зверніть увагу, алель Boc - аллель керує експресією репортерного гена PLAP, позначеного тут Boc PLAP; див. текст ) (а). Фарбування лужною фосфатазою ізольованих адипоцитів WAT від мишей Boc +/PLAP (b). Лужне фосфатазне фарбування ізольованих судин від SVF від WAT мишей Boc +/PLAP та стромальних клітин позначено стрілками (c). Фарбування лужної фосфатази приклеєних клітин від SVF від WAT мишей Boc +/PLAP (d). DAPI фарбування тієї ж культури показано в d (e). C: Напівкількісний RT-PCR-аналіз експресії Boc та Pparγ у WAT, SVF та адипоцитах (Adip.). Gapdh служив контролем завантаження.

Потім експресія BOC була проаналізована за допомогою Вестерн-блоттингу під час диференціювання преадипоцитів 3T3-L1. Рівні BOC були відносно низькими під час росту та сильно індукувались, коли клітини досягли злиття, безпосередньо перед переходом культур на адипогенне індукційне середовище (рис. 6А). Рівні BOC частково знижувались, коли клітини стимулювали диференціюватись, навіть до експресії адипогенних регуляторів PPARγ та C/EBPα, але були відновлені до свого піку на пізніх стадіях диференціації (рис. 6А). GAS1, інший корецептор SHH, експресувався за схемою, подібною до BOC, хоча ефект злиття клітин не спостерігався (рис. 6А). На відміну від BOC та GAS1, паралог CDC BOC ледве виявлявся в клітинах 3T3-L1. CDO сильно експресувався міобластами C2C12, тоді як рівні BOC були низькими в цій клітинній лінії щодо клітин 3T3-L1 (рис. 6А).

Boc -/- MEFs показують посилений адипогенез. В: Вестерн-блот-аналіз різних білків протягом періоду адипогенної диференціації клітин 3T3-L1. Лізати культур клітин 3T3-L1 у середовищі для росту (G) при злитті 60 і 100% (Cnfl.) Або протягом зазначеної кількості днів у середовищі для диференціювання (DM) промокали зазначеними антитілами. β-актин служив контролем навантаження. B: Посилений адипогенез Boc -/- MEFs щодо Boc +/+ MEF. Культури фарбували олійно-червоним O через 15 днів у середовищі диференціювання. C: Кількісне визначення фарбування олійним червоним O за допомогою спектрофотометрії на довжині хвилі 520 нм щодо контрольної проби. Значення є середніми ± SD; n = 3. * P +/+ і Boc -/- MEF. L32 служив контролем завантаження. E: Вестерн-блот-аналіз різних адипогенних білків у Boc +/+ та Boc -/- MEF при D3 та D6.

Щоб дослідити роль ВОС в адипогенезі, ми виділили MEF з ембріонів E13.5 Boc +/+ та Boc -/- та культивували їх у адипогенному індукційному середовищі протягом 15 днів (D15). Boc -/- MEF мали більше О-позитивних колоній олійного червоного при D15, ніж Boc +/+ MEF (рис. 6B та C). Час індукції ліпогенних генів був подібним між Boc +/+ та Boc -/- MEF, але експресія кожного була вищою в Boc -/- MEF, як аналізували напівкількісною RT-PCR (рис. 6D). Крім того, рівні білків aP2, FAS та C/EBPα були підвищені в Boc -/- MEF у D3 та D6, порівняно з контрольними MEF (рис. 6E). Отже, подібно до результатів у Boc -/- мишей, дефіцит Boc призводив до посиленого адипогенезу MEFs in vitro.

Сигналізація SHH пригнічує адипогенез, а BOC сприяє передачі сигналів SHH як корецептора (16,18,20). Отже, ефекти дефіциту ВОС на адипогенез можуть бути пов'язані з ефектами на передачу сигналів SHH. Спочатку ми вирішили це питання, проаналізувавши дорослі Boc +/+ та Boc -/- WAT для рівнів мРНК різних компонентів сигналізації SHH методом qRT-PCR. Ми досліджували експресію Cdo, Gas1, Ptch1 та Gli1; ці гени не тільки кодують компоненти шляху SHH, але їх експресія також регулюється активністю шляху SHH (індукується експресія Ptch1 та Gli1; експресія Cdo та Gas1 пригнічується, принаймні в ранніх ембріонах мишей [11,18]). Експресія Cdo, Gas1 та Ptch1 була значно нижчою для Boc -/- WAT, порівняно з Boc -/- WAT, тоді як експресія Gli1 була подібною (рис. 7А). Ці результати не відразу вказують на значну зміну сигналізації SHH в Boc -/- WAT, але може бути спрощеним припустити, що експресія цих генів регулюється лише активністю SHH у складній тканині, яка також порушена втратою BOC.

Обговорення

Генетичні фактори, що сприяють накопиченню ВАТ, пов’язаного з ожирінням, недостатньо вивчені. Шлях HH відіграє консервативну роль в адипогенезі, інгібуючи утворення жиру (29–32). Миші з підвищеним сигналом HH у всьому світі внаслідок гіпоморфної мутації Ptch1 або в лінії адипоцитів через умовний цілеспрямований мутагенез Суфу різко зменшили ВАТ (33,34). Хоча ці дослідження вказують на те, що генетичний приріст функції в активності шляху HH блокує адипогенез, зворотного не показано, тобто, що знижена функція HH шляху призводить до накопичення WAT.

Інформація про статтю

Фінансування. Це дослідження було підтримано грантом Національного інституту охорони здоров'я http://dx.doi.org/10.13039/100000002 AR-46207 (RSK) та Національним науковим фондом Кореаг http://dx.doi.org/10.13039/501100003725, що фінансується уряд Кореї (NRF-2011-0017315) (J.-SK).

Подвійність інтересів. Не повідомлялося про потенційні конфлікти інтересів, що стосуються цієї статті.

Внески автора. H.-J.L., S.-B.J., A.I.R., H.-J.L., M.-J.K. та S.-H.K. сприяв розробці експериментів, дослідженням, аналізу даних та огляду рукопису. Р.С.К. та J.-S.K. сприяв експериментальному проектуванню, аналізу даних та написання рукопису. Р.С.К. та J.-S.K. є гарантами цієї роботи і, як такі, мали повний доступ до всіх даних дослідження та несуть відповідальність за цілісність даних та точність аналізу даних.

Попередня презентація. Ця робота була представлена як афіша на Міжнародній конференції Корейського товариства молекулярної та клітинної біології, Сеул, Корея, 9–11 жовтня 2013 р.