Надання незамінних симбіотичних амінокислот у американського таргана, Periplaneta americana (Linnaeus) за різних дієтичних умов

Пол А. Айей

1 Кафедра еволюції, екології та біології організмів, Університет штату Огайо, США

Томас Ларсен

2 Лабораторія радіометричного датування та дослідження стабільних ізотопів, Крістіан-Альбрехтс-Університет Кіль, Кіль, Німеччина

Закі Сабрі

1 Кафедра еволюції, екології та біології організмів, Університет штату Огайо, США

Пов’язані дані

Про доступність даних була надана наступна інформація:

Вихідні дані подані як додаткова інформація.

Анотація

Вступ

Комахи, які зберігають дієти з обмеженим вмістом основних поживних речовин, можуть покладатися на мутуалістичний симбіоз (облігатний або факультативний) з мікробами для набуття цих поживних речовин і задоволення вимог щодо росту, плодючості, довголіття та, зрештою, придатності (Douglas, 2009) Докази облігатного забезпечення ендосимбіонтами поживними речовинами та їх вплив на придатність хазяїна були продемонстровані в декількох комах-облігатних ендосимбіонтних системах, таких як горохова попелиця-Бухнера (Prosser & Douglas, 1991; Douglas, Minto & Wilkinson, 2001; Russell et al. ., 2014) та мухи цеце-Вігглсвортіа (Pais та ін., 2008). Однак різноманітність мікробних видів та складність міжвидових взаємодій у кишках господарів комах роблять з’ясування внеску та функцій пов’язаної з кишечником мікробіоти складними. Ця складність додатково ускладнюється значними варіаціями складу громади з часом та стадіями розвитку господаря, а також різницею у фізико-хімічних потребах (кисень та рН), необхідних членам громади для виконання певних функцій (Engel & Moran, 2013).

Друга передумова полягає в тому, що бактерії та гриби генерують чіткі δ 13 підписів CEAA (Larsen et al., 2009). Тому можна визначити, чи не дієтичне/симбіотичне введення ЕАА має бактеріальне або грибкове походження. Це здійснюється в рамках прогнозної моделі з використанням мікробних (бактеріальних та грибкових) та дієтичних δ 13 CEAA як класифікаторів для визначення членства в групі таргана δ 13 CEAA. Цей підхід, який називається 13-методом дактилоскопії, був використаний для визначення біосинтетичного походження EAA у декількох системах (Larsen et al., 2009; Larsen et al., 2011; Larsen et al., 2013; Vokhshoori, McCarthy & Larsen, 2014; Ayayee, Jones & Sabree, 2015; Ayayee et al., 2015). Ми висунули гіпотезу, що забезпечення мікробними ЕАА буде більшим у тарганів, які харчуються з низьким вмістом білка, порівняно з тими, хто харчується з високим вмістом білка. Це було б проілюстровано як більші компенсації ізотопів між тарганами, які харчуються дієтою з низьким вмістом білка, та їх дієтою, а також більшою кількістю тарганів, що харчуються з низьким вмістом білків, призначених мікробним (бактеріям або грибкам) класифікаторам у прогнозній моделі.

Методи та матеріали

Джерело комах

Німфи P. americana 5-го ступеня, використані в цьому дослідженні, були отримані з колонії, що містилася в комірництві кафедри еволюції, екології та біології організму в Університеті штату Огайо, Коламбус, штат Огайо. Значні труднощі, пов’язані з упевненим усуненням Blattabacterium з жирових тіл тарганів, зумовили рішення про використання тарганів, інфікованих Blattabacterium, для зручності та доступності. До експериментів комах утримували в ростовій камері (27 ° C та 29% відносної вологості) та годували гранулами для собачих кормів (27% сирого білка).

Дієтичні експерименти

Підготовка зразка

δ 13 Кількісне визначення та аналіз CEAA

Всі зразки гідролізували та дериватизували у розчині метанолу, піридину та метилхлороформату за допомогою одноетапного методу швидкої дериватизації (Walsh, He & Yarnes, 2014; Chen et al., 2010). Потім приблизно 0,35 мкл аликвот дериватизованих зразків вводили в нерозщеплений вкладиш при 250 ° C зі швидкістю потоку гелію 2,8 мл/хв. Умови та оптимізація під час дериватизації та аналізу проводились, як повідомлялося раніше (Chen et al., 2010; Walsh, He & Yarnes, 2014). Аналізи проводили за допомогою газового хроматографа Trace (Thermo Fisher Scientific), з'єднаного з мас-спектрометром коефіцієнта ізотопного співвідношення Delta V Advantage через GC Combustion Interface III (Thermo Electron, Бремен, Німеччина), використовуючи високополярну колонку VF-23ms (Agilent Technologies) . Температура горіння та зниження температури печі становила 950 ° C та 650 ° C відповідно.

δ 13 CEAA, визначений як R зразка EAA ∕ R стандарт EAA - 1 × 1 000 ‰, де R - відношення важкого до легкого ізотопу в EAA зразка, Rsample EAA та стандарту, Rstandard EAA, було визначено для кожного зразок і відкалібрований за міжнародним стандартом δ 13 C, віденська шкала Pee Dee Belemnite (V-PDB) (Coleman & Fry, 1991). Були проаналізовані дві технічні копії на біологічну пробу. Корекцію на додавання вуглецю під час дериватизації проводили після аналізу (Walsh, He & Yarnes, 2014; Chen et al., 2010). Для всіх зразків були отримані чіткі піки без перекриття для ізолейцину, лейцину, валіну, фенілаланіну та лізину ЕАА з капілярної колонки газового хроматографа. Отримані виправлені вуглецем δ 13 значення CEAA лейцину (Leu), ізолейцину (Ile), лізину (Lys), фенілаланіну (Phe) та валіну (Val).

Статистичний аналіз

Змішаний аналіз моделі та середнє відокремлення (t-тест Стьюдента, P = 0,05) проводили для даних LQD та DF δ 13 CEAA за допомогою JMP 10 (SAS Inc., NC, США). Окремі компенсації Δ 13 C між 5 EAA для зразків тарганів та харчових продуктів визначали як: Δ 13 CEAA = δ 13 CCockroEAEAA - δ 13 CDiet EAA. Групи були; неякісна дієта (LQD), придатки плотви, що харчуються LQD, фільтрат кишок плотви, що годується LQD, корм для собак (DF), придатки плотви, що годується DF, і фільтрат кишок плотки, що годується DF.

Ми використали лінійний аналіз дискримінантної функції (LDA), використовуючи δ 13 навчальних даних CEAA з еталонних зразків бактерій та грибів (Larsen et al., 2013), а також дієтичні зразки LQD та DF для створення прогнозної моделі. Дані δ 13 CEAA, отримані від грибка Fusarium solani (n = 2), використані в попередньому дослідженні та проаналізовані на тому ж об'єкті, що і ці зразки, були включені в модель для перевірки (Ayayee et al., 2015). Класифікацію зразків відомих грибів та приналежність до зразків тарганів групи визначали за допомогою пакету R MASS (Venables & Ripley, 2002).

Результати

Δ 13 С-компенсації, виявлені між тарганами, що харчуються LQD та DF, та відповідними дієтами

Визначений суттєвий загальний модельний ефект як для зразків тарганів, що харчуються DF, так і для LQD, та їх відповідних дієт (F (29160) = 110, P 13 CEAA були виявлені серед усіх груп у всіх 5 вимірюваних EAA (F (5,184) = 263, P Таблиця 1). Середнє позитивне Δ 13 Зміщення C для зразків плотви, що годували DF, і зразків фільтрату кишечника, що годували DF, становило відповідно 1,30 ± 0,18 ‰ та 1,4 ± 0,18 ‰ (середнє значення ± se) відносно DF-дієти (0 ‰), тоді як середнє Δ 13 C -зсув між придатками плотви, що харчуються LQD, та зразками фільтрату кишок плотви, що харчуються LQD, становили відповідно 7,8 ± 0,2 ‰ та 4,6 ± 0,2 ‰ (середнє значення ± se), відносно дієти LQD (0 ‰) (таблиця 1). Також були визначені суттєві відмінності в δ 13 CEAA 5 виміряних EAA (F (4,185) = 411, P 13 C-компенсації між зразками тарганів, що харчуються DF та LQD, та їх дієтами для кожного з 5 EAA показано на рис. 1. Як для зразків тарганів, що харчуються DF, так і для LQD, зсуви були найбільшими для лізину та валіну (тобто збагачені 13 С), а потім - лейцину, ізолейцину та фенілаланіну. Загалом, ступінь Δ 13 С -ізотопний зсув був вищим у зразках тарганів, що годувались LQD (6,2 ± 0,2 ‰, середнє значення ± se), порівняно із зразками тарганів, що годувались DF (1,35 ± 0,18 ‰, середнє значення ± se) (рис. 1). Дані CEAA, використані для аналізу, представлені в таблиці S1.

Таблиця 1

Використовуваними EAA були ізолейцин (ile), лейцин (leu), лізин (lys), фенілаланін (phe) та валін (val). Показані компенсації придатку плотви, що харчується LQD, фільтрату кишок плотви, що харчується LQD, і дієти LQ (n = 3, кожна), а також дієти DF (n = 3), придатку плотви, що годується DF, і DF- годували зразки фільтрату кишок плотви (n = 4, кожен).

Прогнозований опис та перевірка моделі

LDA використовували для визначення приналежності зразків тарганів до групи бактеріальних, грибкових або дієтичних класифікаторів. На графіках LDA 95% межі довіри для груп класифікаторів зображуються у вигляді еліпсів (пунктирні лінії), а межі прийняття рішень між групами класифікаторів зображуються пунктирними лініями, що розділяють класифікатори. Попередні ймовірності, тобто ймовірність того, що конкретна вибірка належала до тієї чи іншої з трьох груп класифікаторів, тоді прогнозували після встановлення моделі. Чим більша відстань певного споживача від центроїда класифікаційної групи (тобто потенційного джерела EAA), тим більша ймовірність змішування джерел EAA. Дискримінаційні бали споживачів, що виходять за межі 95% довіри їх дієтичних джерел, інтерпретуються як сильні показники недієтичного/симбіотичного забезпечення EAA, враховуючи чіткий бал дискримінації між класифікаторами.

Валідація моделі була підтверджена шляхом правильного і чіткого розділення зразків бактерій (n = 12) та грибків (n = 7) у наборі даних для тренувань на відповідні групи (F (15,78) = 12,6, P Таблиця 2 та рис. 2). Модель також класифікувала дієтичні джерела (дієта LQ, n = 3 та дієта DF, n = 2), на відміну від групи класифікаторів бактерій, але подібну до групи класифікаторів грибів. Це, швидше за все, відображає внесок грибкових білків (дріжджовий екстракт) у дієту LQ та грибкового компонента (пивних дріжджів) у складі сирої білкової дієти у дієті DF. Нарешті, валідність моделі була підтверджена правильним розміщенням двох зразків грибів F. solani в межах 95% межі довіри групи класифікаторів грибів (рис. 2).

Таблиця 2

Короткий зміст прогнозної моделі, заснованої на класифікації та оцінках задньої ймовірності грибкового (n = 7) та бактеріального (n = 12) класифікаторів, а також LQD (n = 3) та DF (n = 2), що використовуються у навчальному наборі даних у аналіз LDA.

Імовірність (%)Фактичний зразокBacteriaDietFungi

Гриби	0,00	18.40	81.60
Гриби	0,00	0,54	99,46
Гриби	0,00	0,26	99,74
Гриби	0,00	0,00	100,00
Гриби	0,00	0,00	100,00
Гриби	0,00	0,38	99,62
Гриби	0,00	0,07	99,93
Бактерії	100,00	0,00	0,00
Бактерії	100,00	0,00	0,00
Бактерії	100,00	0,00	0,00
Бактерії	100,00	0,00	0,00
Бактерії	100,00	0,00	0,00
Бактерії	100,00	0,00	0,00
Бактерії	100,00	0,00	0,00
Бактерії	100,00	0,00	0,00
Бактерії	100,00	0,00	0,00
Бактерії	100,00	0,00	0,00
Бактерії	100,00	0,00	0,00
Бактерії	99,99	0,01	0,00
Неякісна дієта (ЛКД)	0,00	99,99	0,01
Неякісна дієта (ЛКД)	0,00	99,99	0,01
Неякісна дієта (ЛКД)	0,00	100,00	0,00
Дієта для собачих кормів	0,00	96,36	3.64
Дієта для собачих кормів	0,00	97,49	2.51

Обговорення

У цьому дослідженні ми виявили симбіотичні (мікроорганізми кишечника та Blattabacterium) вхідні дані як у тарганів, що годуються LQD, так і у DF, що харчуються DF, в умовах контрольованого вигодовування, використовуючи аналізи δ 13 CEAA, хоча забезпечення EAA було порівняно вищим у DF, що годується таргани, всупереч нашій гіпотезі. Ми не робимо різниці між забезпеченням EAA мікробами кишечника або жирним тілесним облігатним симбіонтом Blattabacterium, оскільки ми не використовували тарганів, що не містять Blattabacterium. Аспекти надання симбіотичних EAA в обох дієтичних умовах та потенційні джерела недієтичних EAA обговорюються нижче.

Проте, розкрите в цьому дослідженні надання симбіотичного ЕАА, не обов'язково повинно бути виключно Blattabacterium або мікробною кишкою, і, ймовірно, це функція обох. Ми вважаємо, що інтерпретація результатів цього дослідження як показників симбіотичного введення ЕАА (Blattabacterium та кишкової мікробної речовини) як у тарганів, що харчуються DF, так і в LQD, має свої переваги, незважаючи на обмежені обсяги вибірки. Ми прагнули використати підхід δ 13 CEAA для надання даних для подолання розриву між потенційними можливостями симбіонтів, такими як забезпечення EAA (про що свідчать геномні, метагеномні та метатранскриптомічні дослідження), і продемонстрували функцію симбіонту, таку як передача EAA між симбіонтом та господарем ( на основі 13 аналізів С-відбитків пальців). Це дослідження являє собою перше дослідження симбіотичного забезпечення ЕАА у P. americana з використанням цієї методики та забезпечує основу для подальших досліджень, спрямованих на розплутування мікрофлори кишечника та введення ЕАА Blattabacterium з використанням вільних від Blattabacterium та інфікованих осіб в різних дієтичних умовах.

На закінчення, визначене введення симбіотичного ЕАА як у тарганів, що харчуються LQD, так і у DF, що підгодовується, підкреслює корисність підходу 13 C-відбитків пальців у дослідженні симбіотичної функції. Було показано, що дієтична якість впливає на симбіотичний вміст ЕАА, хоча певний вміст ЕАА у тарганів, що харчуються ДФ, суперечить нашим сподіванням на незначну кількість симбіотичного ЕАА щодо високоякісної дієти, що викликає подальші питання про роль дієти, мікробіоти кишечника, зобов’язаний ендосимбіонт та хазяїн у регулюванні забезпечення мікробною ЕАА у відповідь на вимоги ЕАА хазяїна.