Місцевий фітнес-ландшафт зеленого флуоресцентного білка

Предмети

Анотація

Ми проаналізували місцевий ландшафт фітнесу avGFP, оцінивши рівні флуоресценції генотипів, отриманих шляхом випадкового мутагенезу послідовності avGFP (рис. 1). Ми використали сортування клітин, що активується флуоресценцією (додаткова фіг. 1), і послідовно розподілили всю область кодування GFP, щоб проаналізувати флуоресценцію багатьох тисяч генотипів, створених шляхом випадкового мутагенезу послідовності дикого типу (додаткова інформація 2 та розширені дані, рис. 1) . Ми застосували кілька стратегій, щоб мінімізувати помилку нашої оцінки флуоресценції (Додаткова інформація 3.4 та 4.4), яка була оцінена на основі тисяч незалежних вимірювань послідовності дикого типу (коефіцієнт помилково негативних помилок = 0,08%) та генотипів, що включають мутації, відомі усунути флуоресценцію (коефіцієнт помилково позитивних помилок = 0,24%). Наш остаточний набір даних включав 56 086 унікальних послідовностей нуклеотидів, що кодують 51 715 різних білкових послідовностей. Наша процедура вводила в середньому 3,7 мутації на послідовність генів, і більшість аналізованих генотипів містили кілька, до 15, помилкових мутацій. Тим не менше, оскільки загальна кількість можливих послідовностей зростає експоненціально із числом мутацій, частка послідовностей, відібраних для вибірки, була незначною для послідовностей, що містять більше двох мутацій (Розширена таблиця даних 1). Ми використовували ці дані для обстеження місцевого фітнес-ландшафту GFP, аналізуючи ефект одиночної, подвійної та множинної мутацій.

a, Дикий тип avGFP (в центрі) та більшість поодиноких мутантів (внутрішнє коло) флуоресцирують зеленим. Генотипи з множинними мутаціями можуть виявляти негативний епістаз, поєднання нейтральних мутацій, що створюють не флуоресцентні фенотипи (сірий), або позитивний епістаз, при якому мутація в нефлуоресцентному генотипі відновлює флуоресценцію. b, Послідовність GFP розташована по колу, кожна колонка являє собою один амінокислотний сайт. У першому колі інтенсивність кольору квадратів вказує на яскравість одиничної мутації на відповідному ділянці щодо дикого типу, показаного в центрі. Сайти з позитивною та негативною епістатичною взаємодією між парами мутацій пов’язані відповідно зеленою та чорною лініями. У колах, віддалених від центру, що представляють генотипи з множинними мутаціями, фракція колонки, пофарбована зеленим (чорним), представляє частку генотипів, що відповідає високій (низькій) флуоресценції серед усіх досліджуваних генотипів з мутацією в цьому місці. Ножиці позначають місце обмеження.

10% мутантних станів, що надають не флуоресцентний фенотип, тим не менше були зафіксовані при тривалій еволюції (Розширені дані, рис. 3b), і значна частина генотипів, що містять лише мутації, що ведуть до амінокислотних станів з ортологів GFP, була не флуоресцентною (додатковий Рис. 3), що вказує на те, що епістаз впливає на фітнес-пейзаж avGFP 16 .

a, Розподіли самостійно виміряної флуоресценції для 2442 послідовностей дикого типу (сірий), 1114 одиночних мутантів (синій) та оцінювана частка нейтральних мутацій (білий). b, c, Поодинокі мутації місенсу, що сильно зменшують флуоресценцію (фіолетові), як правило, виникають на ділянках із внутрішньо орієнтованими залишками (b), показаний на вибраному β-ланцюзі структури GFP (c).

a, Гіпотетичне представлення негативного та позитивного епістазу як функції кількості одиничних мутацій від avGFP. WT, дикий тип. b, Частка спостережуваних нефлуоресцентних генотипів (червоний) та очікувана частка нефлуоресцентних генотипів, розрахована як сума ефектів логарифмічної флуоресценції окремих мутацій (синій). c, Розподіли епістазів для негативних та позитивних епістазів різної сили з очікуваною швидкістю помилкових виявлень показані сірим кольором.

Негативний епістаз вражав до 30% усіх генотипів, залежно від кількості мутацій (рис. 3б, в), що призвело до більшої, ніж очікувалося, частки нефлуоресцентних генотипів (рис. 3в). Генотипи, що несуть більше семи мутацій, продемонстрували зменшення поширеності негативних епістазів, оскільки багато генотипів, що носять множинні мутації, втрачали флуоресценцію навіть без епістазу (рис. 3б). Позитивний епістаз був рідкісним у avGFP, на порядок точності нашого методу. Ми взяли вибірку

2% усіх можливих пар мутацій (таблиця розширених даних), аналізуючи 30% пар амінокислотних сайтів (16 898 з 55 696, розширені дані, рис. 4а). Епістатичні пари сайтів були розташовані по всій послідовності avGFP (Розширені дані Рис. 4a), переважно поза межами прямої фізичної взаємодії амінокислотних залишків (Розширені дані Рис. 4b), але незначно ближче, ніж випадкові (Розширені дані Рис. 4c, P 8,20. Нарешті, епістаз був більш поширеним між парами сайтів, в яких обидва залишки орієнтовані внутрішньо (Розширені дані, рис. 4e). У сукупності ці дані вказують на те, що епістаз частіше зустрічався на функціонально важливих ділянках.

У одновимірному ландшафті фітнес - це монотонна функція проміжної змінної, відома як потенціал фітнесу 21,22, що є сумою ефектів від окремих мутацій. Ми використовували множинну регресію, враховуючи неепістатичну функцію фітнесу, при якій логарифмічна флуоресценція, F, дорівнює лінійному предиктору, фітнес-потенціалу, стор, такий, що F = f(стор) = стор. Ця найпростіша, неепістатична модель пояснила лише 70% початкової дисперсії вибірки (σ 2 = 1,12 і σ 2 = 0,34 до та після застосування моделі відповідно). Використовуючи дисперсію 2442 вимірювань флуоресценції дикого типу, ми підрахували, що

1% початкової дисперсії вибірки можна віднести до шуму (σ 2 = 0,0097), що вказує на те, що решта 29% відхилення вибірки неможливо пояснити без епістазу.

Найпростіша форма епістатичної функції фітнесу - це коли фітнес є монотонною нелінійною функцією стор 21,22. Відсутність генотипів з проміжною флуоресценцією (розширені дані, рис. 5а) свідчить про те, що ландшафт avGFP fitneses можна описати за допомогою усіченої функції фітнесу 23. Тому ми змоделювали F як сигмовидної функції стор, що пояснювало 85% початкової дисперсії вибірки (σ 2 = 0,17). Більш складна фітнес-функція сигмовидної форми, вдосконалена за допомогою нейромережевого підходу (Додаткова інформація 4.6), пояснила 93,5% початкової дисперсії вибірки (σ 2 = 0,065, Розширені дані Рис. 5), що підтверджує, що фітнес-ландшафт в основному може бути представлений одновимірною пороговою функцією (рис. 4), яка може виникнути внаслідок спільного вкладу мутацій у стабільність білка 8,13,14,20, 24. Середня флуоресценція одиночних мутантів avGFP як функція прогнозованої дестабілізації білка, ΔΔG, виявляє поріг близько 7–9 ккал моль -1 (рис. 4). Примітно, що приховане значення, знайдене штучною нейронною мережею для одиночних мутантів, корелювало із передбачуваним ΔΔG (Рис. 4 та Розширені дані Рис. 5f), що підтверджує ймовірний вплив стабільності білка на природу епістазу в avGFP. Порогова функція фітнесу робить надзвичайно хорошу роботу в наближенні всього фітнесу, пояснюючи це

95% усіх відхилень. Однак, беручи до уваги рівень помилок нашого набору даних, ми підрахували, що принаймні 0,3% генотипів не можна пояснити функцією порогової придатності (Додаткова інформація 4.5 та Розширені дані, рис. 5г), що представляє випадки багатовимірного епістазу 2, 5,7 .

Середня флуоресценція GFP з одиничними мутаціями як функція їх впливу на прогнозовану енергію згортання (ΔΔG), накладений на незалежно отриману сигмоподібну функцію фітнесу, передбачену нейронною мережею (оранжева лінія). Стовпчики помилок позначають s.d.

Нормалізована швидкість збіжної еволюції до кінцевих та реконструйованих родових амінокислотних станів для кожної коробки відстані (сірі крапки). Очікувана (оранжева лінія) та спостерігається в експериментальних даних (оранжеві точки) ймовірність того, що одинична мутація залишається флуоресцентною, оскільки послідовність накопичує інші заміни. Очікувана (зелена лінія) та спостережувана (зелені точки) ймовірність того, що нефлуоресцентна мутація стане флуоресцентною з розбіжністю послідовностей. Стовпчики представляють біноміальний пропорційний довірчий інтервал (рівень довіри 68%).

Широке збіг наших даних із поширеністю епістазів при тривалій еволюції свідчить про те, що форму місцевого фітнес-ландшафту можна екстраполювати у більшому масштабі. Проте епістаз між сайтами, що кодують залишки з безпосередньою взаємодією в структурі білка, був рідкісним, на відміну від спостереження таких випадків при тривалій еволюції 16 та аналізу мутації домену мотиву розпізнавання РНК (RRM) 12. Таким чином, місцевий ландшафт фітнесу, що охоплює кілька мутацій з одного піку фітнесу, може бути апроксимований одновимірною функцією порогового потенціалу фітнесу; однак ця проста функція фітнесу може бути непридатною для опису ландшафтів фітнесу, які включають фітнес-хребти, що з'єднують послідовності більш різнорідних ортологів 27. Залишається дослідити природу глобальних фітнес-ландшафтів, особливо взаємодію між місцевими та глобальними масштабами.