Мікробний дисбіоз асоціюється з раком молочної залози людини

Affiliation Dirks/Догерті Лабораторія з дослідження раку, Департамент поступальної імунології, Інститут раку Джона Уейна, Санта-Моніка, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

Відділення патології приналежності, Центр охорони здоров’я Святого Джона, Санта-Моніка, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

Афілійований медичний відділ Медичного центру Седарс-Сінай, Лос-Анджелес, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

Приналежність Центру грудей Марджі Петерсен, Центр здоров'я Сент-Джонс, Санта-Моніка, Каліфорнія, Сполучені Штати Америки

Кайюнь Сюань,
Хайме М. Шамонкі,
Аліса Чунг,
Меґі Л. ДіНом,
Морін Чунг,
Пітер А. Сілінг,
Дельфіна Дж. Лі

Цифри

Анотація

Цитування: Xuan C, Shamonki JM, Chung A, DiNome ML, Chung M, Sieling PA та ін. (2014) Мікробний дисбіоз асоціюється з раком молочної залози людини. PLoS ONE 9 (1): e83744. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083744

Редактор: Казуакі Такабе, Медичний факультет Університету Співдружності Вірджинії, Сполучені Штати Америки

Отримано: 19 липня 2013 р .; Прийнято: 6 листопада 2013 р .; Опубліковано: 8 січня 2014 року

Фінансування: Цю роботу підтримали Керолін Діркс та Бретт Догерті, Фонд Джозефа Б. Гулда, Асоціація досліджень раку молочної залози та молочної залози (Лос-Анджелес) та Асоціація модного взуття Нью-Йоркського благодійного фонду (Нью-Йорк). Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

У кожної восьмої жінки протягом життя діагностують рак молочної залози. Це друга причина за смертністю серед жінок, щорічно> 40 000 смертей [1]. Незважаючи на 5,5 млрд. Доларів, витрачених на дослідження раку молочної залози за останні двадцять років, походження більшості випадків раку молочної залози (за оцінками досягає 70%) залишається невідомим [2]. Дуже важливо зрозуміти, як виникають ці спорадичні раки молочної залози, щоб розробити профілактичні стратегії проти цієї руйнівної хвороби. Недавнє оцінювання впливу мікробіоти на здоров’я та хвороби людини породжує питання про те, чи відіграють мікроби роль у епізодичному раку молочної залози невідомої етіології.

Мікроби, що населяють людський організм, перевищують кількість клітин людини 10: 1. Їх вплив на здоров’я та хвороби людини - це нова сфера досліджень, яка швидко розширюється. Мікроби пов’язують із такими різноманітними захворюваннями, як ожиріння [3], [4], рак товстої кишки [5], [6] та коліт [7]. У осіб із ожирінням співвідношення твердих речовин до бактеріоїдів у товстій кишці значно вище, ніж у худих особин [3], [8]. Розміщення людей з ожирінням на дієтах з низьким вмістом жиру призвело до зменшення цього співвідношення, хоча і не до рівня, який спостерігається у худорлявих осіб [8]. При раку товстої кишки надлишок одного виду бактерій Fusobacterium nucleatum корелює із захворюваннями та підвищеною ймовірністю метастазування в лімфатичні вузли [6]. На відміну від патогенної природи Fusobacterium при раку товстої кишки, бактерія Bacteroidetes fragilis чинить захисний ефект проти коліту, модулюючи запальні імунні реакції в кишечнику [9]. З цих та інших останніх досліджень стає все більш очевидним, що як склад спільноти, так і окремі види бактерій можуть чинити як патогенні ефекти, що стимулюють розвиток хвороби, так і пробіотичні ефекти, що підтримують стан здоров'я.

Попередні дослідження мікробних причин раку молочної залози були зосереджені на конкретних вірусах та їх потенційному внеску в рак молочної залози. Хоча деякі групи повідомляли про інфікування ВПЛ, пов’язане з раком молочної залози [10], [11], [12], іншим не вдалося знайти кореляцію [13], [14]. Подібним чином деякі групи повідомляли, що до 50% пухлин молочної залози є EBV-позитивними [15], [16], [17], [18], тоді як інші взагалі не змогли виявити вірус у пухлинах молочної залози [19], [20]. На відміну від вірусів, бактерії в грудях вивчались у значно меншій мірі. Кілька груп досліджували бактерії, відповідальні за інфекції, що виникають внаслідок процедур імплантації молочної залози, використовуючи культурологічні методи [21]. Крім того, було показано, що в грудному молоці здорових жінок міститься безліч видів бактерій, включаючи загальноприйняті шкірні бактерії [22], [23]. Бактерії в молочній залозі вивчали в контексті інфекцій та у здорових людей, але не повідомлялося про всебічне дослідження бактерій при раку молочної залози. Тут ми охарактеризували та порівняли мікробіоти пухлини молочної залози та спарену нормальну тканину та виявили дисбіоз, пов’язаний із станом та тяжкістю захворювання на рак молочної залози.

Матеріали і методи

Заява про етику отримання зразків тканин молочної залози

Формалін із фіксованим вкладеним у парафін (FFPE) та свіжозаморожені тканини молочної залози отримували із Центру охорони здоров’я Сент-Джон у відповідності до інституційних вимог IRB, затверджених спільною інституційною комісією з огляду інститутів раку Сент-Джона/Інститутом раку Джона Уейна та західною інституційною комісією з огляду IRB). Затверджуюча IRB спеціально відмовилася від письмової згоди.

Вилучення геномної ДНК (гДНК) з тканини FFPE

Загальну геномну ДНК витягували з тканин молочної залози FFPE за допомогою набору тканин QIAamp DNA FFPE відповідно до інструкцій виробника з невеликими змінами. Очищену гДНК двічі елюювали з колонки за допомогою надчистої води. Всі екстракції проводили у призначеному для цього чистому приміщенні (до ПЛР).

16S піросеквенування

Кількісна ПЛР (qPCR) для кількості бактеріальних копій

qPCR масив

Враховуючи чудову якість мРНК із свіжозамороженої тканини, ми вирішили використовувати свіжозаморожену тканину, а не фіксовану, вбудовану в парафін тканину, у нашому дослідженні експресії генів. РНК виділяли із свіжозамороженої тканини молочної залози у трьох здорових пацієнтів з редукційною мамопластикою та з пухлинної тканини шести пацієнтів з раком молочної залози (Суб'єкти 42-47), потім перетворювали на кДНК за допомогою набору синтезу кДНК iScript (Biorad). кДНК додавали до ПЛР-масивів антибактеріальної реакції людини (Qiagen), і масиви обробляли відповідно до інструкцій виробника. Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення для аналізу даних масиву ПЛР RT 2 Profiler версії 3.5, використовуючи експресію гена бета-актину для нормалізації.

Статистичний аналіз

T-тести Стьюдента, непараметричні ANOVA-тести Крускала-Уолліса та кореляційні тести Спирмена проводились за допомогою програмного забезпечення Graphpad Prism (Graphpad). Тести Cuzick's Trend проводились із використанням статистичного програмного забезпечення StatsDirect (StatsDirect). p Рисунок 1. Огляд мікробних спільнот, що проживають у тканинах молочної залози у хворих на рак молочної залози.

A) Розподіл рівня мікробіологічних спільнот за рівнем порівняння парних нормальних сусідніх („парних нормальних”) та тканин раку молочної залози у 20 пацієнтів з ER-позитивним раком молочної залози (n = 20). Кожна смужка представляє 100% бактерій, виявлених у даному зразку. B) Комбінований розподіл на рівні типу в парній нормальній тканині та тканині пухлини молочної залози (n = 20). C.) Кількість OTU, знайдених у кожній громаді (n = 20). D) Аналіз ОТУ з різною чисельністю між парною нормальною та пухлинною тканиною (n = 20). Е) Кореляція відносної чисельності M. radiotolerans та S. yanoikuyae (n = 20). F) Відносна кількість поширених шкірних бактерій (n = 20). Наведені значення р з парного t-тесту Стьюдента, з Р Малюнок 2. Кількісне визначення бактеріального навантаження в тканині здорових хворих та хворих на рак молочної залози.

A) Номери копій бактеріального гена 16S порівнювали між здоровою (за віком) (n = 23), парною нормальною (n = 39) та пухлинною тканиною (n = 39). Здорові зразки отримували у пацієнтів, яким проводили редукційну мамопластику, без ознак раку молочної залози. Статистичний аналіз проводили з використанням непараметричного ANOVA Крускала-Уолліса з пост-тестом множинного порівняння Данна. B) Бактеріальне навантаження в тканині згідно клінічної стадії зразка пухлини. Статистичний аналіз проводили за допомогою критерію Cuzick’s Trend. Усі статистичні аналізи вважались значущими, коли P Рисунок 3. Профілі експресії генів антибактеріальної відповіді у здоровій тканині та тканині раку молочної залози (n = 9).