Межі в галузі біоінженерії
та біотехнології

Біопроцесорна інженерія

Ця стаття є частиною Теми дослідження

Постійне біовиробництво в мікробних системах Переглянути всі 8 статей

Редаговано
Мігель К. Тейшейра

Лісабонський університет, Португалія

Переглянуто
Георг А. Шпренгер

Університет Штутгарта, Німеччина

Сесілія Каладо

Лісабонський вищий інженерний інститут (ISEL), Португалія

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

межі

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 Науково-дослідний відділ біохімічної інженерії, Група досліджень інтегрованого розвитку біопроцесів, Інститут хімічної, екологічної та біологічних наук, Віденський технологічний університет, Відень, Австрія
  • 2 Крістіана Доплера Лабораторія механічних та фізіологічних методів для вдосконалення біопроцесів, Інститут хімічної, екологічної та біологічних наук, ТУ Відень, Відень, Австрія
  • 3 Навчально-дослідний центр TERRA, Мікробні процеси та взаємодії (MiPI), Gembloux Agro-Bio Tech - Університет Льєжу, Gembloux, Бельгія

Вступ

Сьогодні більшість процесів залежать від періодичного режиму подачі, який є найсучаснішим у галузі. На них можуть сильно впливати різні параметри процесу, такі як рН та Т, фізіологічне харчування (адаптація конкретної швидкості поглинання субстрату) та зміна індукційного агента. Однак тимчасова залежність якості продукції все ще є головним недоліком використання цієї техніки вирощування. Це часто визначає правильний час збирання врожаю, оскільки внутрішньоклітинний стрес часто призводить до дуже швидкого лізису клітин та деградації продукту. Це призводить до варіацій у процесі очищення нижче за течією. Вважається, що безперервне біовиробництво підвищує якість продукції, а отже, полегшує подальший процес. Однак до теперішнього часу було встановлено лише один стабільний мікробний процес промислового хемостату Saccharomyces cerevisiae у 90-х для виробництва інсуліну (Diers et al., 1991). Падіння продуктивності після певного часу процесу та менший часовий простір перешкоджають постійному застосуванню мікробних господарів у промисловості (Peebo and Neubauer, 2018; Kopp et al., 2019b).

У цьому внеску ми представляємо результати культури хемостатів із використанням систем змішаних кормів, вперше застосованих Wurm et al. (2016, 2018). Метою було досягти безперервного процесу зі стабільною продуктивністю, що перевищує часто використовувану порцію. Ми протестували змішані корми з глюкозою/лактозою та гліцерином/лактозою в хемостаті для трьох модельних білків та порівняли показники з найсучаснішими партіями годувань, індукованими IPTG. На відміну від культивувань із використанням BL21 (DE3) з глюкозою/лактозою, культивування на основі гліцерину/лактози продемонструвало відновлення продуктивності при збільшеному часі індукції. Зміни щодо вибору джерела вуглецю, таким чином, можуть стати ключовим фактором, що дозволяє забезпечити стабільну продуктивність на довгостроковій основі. Оскільки вже втрачена продуктивність відновлюється, ми прокоментували це воскресіння продуктивності християнським терміном «Лазар» та відповідним «ефектом Лазаря».

Матеріали і методи

Штами

Культивування проводили із штамом Кишкова паличка Bl21 (DE3) з використанням трьох різних модельних білків. Всі три білкові послідовності клонували у векторах pET, використовуючи pET21a + для зеленого флуоресцентного білка (GFP) та pET28a для білка mCherry (mCherry) та Blitzenblue (BBlue). На щастя, mCherry та BBlue були отримані від професора Маурера у FH Campus Wien. Усі культури витримували при -80 ° C у 25% -ному запасі гліцерину кріо. Екстраговану плазміду pET21a +, що кодує GFP, екстрагували та електропорували у штам HMS174 (DE3) (Novagen, Merck, Дармштадт, Німеччина).

Режими вирощування та обробки

Культивування проводили в системі біореакторів Minifors 2 (макс. Робочий об’єм: 1 л; Infors HT, Ботмінген, Швейцарія). Всі культивування проводили з використанням визначеного мінімального середовища, згаданого у DeLisa та співавт. (1999). Носії мали однаковий склад з різною кількістю гліцерину та глюкози. Детальна інформація про культивування, періодичне вигодовування, періодичне вигодовування та вирощування хемостатів наведено в таблиці 1. Індукцію проводили згідно з таблицею 1. Співвідношення гліцерину до лактози було розраховано на основі нещодавніх робіт у поданій партії щодо максимального поглинання лактози проти застосованого q, C (Wurm et al., 2016). Готову партію завжди культивували, щоб мати стандарт виробництва білка з аналогічною питомою швидкістю росту, як це застосовується в хемостаті. Потік культивування відхідних газів аналізували в Інтернеті за допомогою газових датчиків - ІЧ для СО2 та ZrO2 на основі кисню (BlueSens Gas analytics, Гертен, Німеччина). Контроль процесу та подача був встановлений за допомогою системи управління технологічним процесом PIMS Lucullus (Securecell, Урдорф, Швейцарія).

Таблиця 1. Джерело С та індукція для різних культур.

Ми використовували глюкозу або гліцерин як джерело вуглецю та 0,5 мМ IPTG для індукції. Протягом усіх фаз індукції рН підтримується постійним на рівні 6,7 і температурою на рівні 30 ° С. рН контролювали лише підставою (12,5% NH4OH), тоді як кислоту (10% H3PO4) додавали вручну, якщо це необхідно. РН контролювали за допомогою датчика рН EasyFerm Plus (Hamilton, Reno, NV, США). Аерацію проводили із застосуванням суміші повітря під тиском та чистого кисню при приблизно 2 об./Хв., Щоб підтримувати розчинений кисень (dO2) завжди вище 30%. Розчинений кисень контролювали за допомогою флуоресцентного розчиненого кисневого електрода Visiferm DO (Hamilton, Reno, NV, США).

Для поданих партій статичного подавання прямого qs-контролю проводили під час фази індукції. Експоненціальна подача була встановлена ​​відповідно до рівняння. 1, щоб підтримувати qs, C постійною (Slouka et al., 2016; Wurm et al., 2016):

При цьому F - швидкість подачі [г/год], qs, C - питома швидкість поглинання гліцерину [г/г/год], X (t) - абсолютна біомаса [г], ρF - щільність подачі [г/л] і cF концентрація корму [г/л] відповідно. Для застосованих стратегій управління адаптацію qs, C протягом часу індукції проводили на основі рівняння. 1. Культивування хемостату встановлювали вручну на швидкість розведення D = 0,1 год –1 для всіх виконаних прогонів.

Аналіз процесів

Для поданої партії зразки завжди відбирали після щеплення, після закінчення фази партії та після закінчення неіндукованої поданої партії. Протягом періоду індукції зразки відбирали з інтервалом не більше 120 хв і аналізували згодом. Подробиці аналітики процесів можна знайти деінде (Kopp et al., 2018; Slouka et al., 2018). Для культивування хемостатів зразки збирали після партії, а потім один раз, або, якщо необхідно, двічі на день.

Аналіз продуктів

Підготовка

Зразки ферментаційного бульйону 5 мл центрифугували при 4800 об/хв при 4 ° С протягом 10 хв. Надосадову рідину відкидали, і гранулу ресуспендували до DCW приблизно 4 г/л у буфері для лізису (100 мМ Трис, 10 мМ ЕДТА при рН = 7,4). Потім зразок гомогенізували за допомогою гомогенізатора Gea PandaPlus (Gea, AG, Німеччина) при 1500 бар протягом 10 пасажів. Після центрифугування при 10000 об/хв і 4 ° С протягом 10 хв 10 мл супернатанту витримували для аналізу розчинного білка. Розчинний білок зберігали при 4 ° С. Отриману гранулу IB двічі промивали надчистою водою. Аликвоти гранул на 2 мл бульйону знову центрифугували (14000 об/хв, 10 хв 4 ° C) і, нарешті, зберігали при -20 ° C.

Титр тіла включення

Результати

Готові періодичні вирощування, індуковані IPTG, є золотим стандартом для RPP з Кишкова паличка. Щоб мати змогу конкурувати з партіями, що харчуються, питома продуктивність у культивуванні хемостатів повинна бути максимізована і тривалість фази продуктивності подовжена, так що врожайність у часовому просторі значно збільшується. Ми протестували дві системи змішаного харчування, глюкоза/лактоза та гліцерин/лактоза, щоб знайти умови для стабільної експресії білка в Кишкова паличка хемостатики.

Застосовується і хемостати, що використовують Bl21 (DE3), що виражає GFP як модель білка

Спочатку ми порівняли три різні режими культивування, використовуючи GFP як модельний білок. Оскільки IPTG часто називають токсичним для клітин через певний час індукції, ми спочатку використовували лактозу як м’який індуктор (Dvorak et al., 2015). Комбікорм, що складається з глюкози та лактози (табл. 1), використовували для першого хемостату (рис. 1). Для полегшення порівнянності між подаченою партією та культивуванням хемостату ми націлилися на подібні специфічні швидкості поглинання субстрату - qs, C, що призвело до швидкості розведення для хемостатів 0,1 год –1. Відповідні параметри процесу представлені в таблиці 2.

Фігура 1. Порівняння між (A) годують партією, (B) хемостат, що харчується глюкозою/лактозою, та (C) хемостат гліцерин/лактоза для отримання рекомбінантного GFP з використанням Bl21 (DE3).