Межі у фізіології

Інтегративна фізіологія

Ця стаття є частиною Теми дослідження

Досягнення в метаболічних механізмах старіння та пов’язаних із цим захворюваннях Переглянути всі 11 статей

Редаговано
КАТІЯ АКВІЛАНО

Римський університет Тор Вергата, Італія

Переглянуто
Еверардо М. Карнейро

Кампінаський державний університет, Бразилія

Марсія К. Латорка

Федеральний університет імені Мату-Гросу, Бразилія

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

дефект

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 кафедра патофізіології, Міжнародний медичний інститут Хунцяо, лікарня Тунгрен, ключова лабораторія диференціації клітин та апоптозу Міністерства освіти Китаю, Шанхайська медична школа Університету Цзяо Тун, Шанхай, Китай
  • 2 Кафедра кардіології, Пекінська лікарня, Четвертий військово-медичний університет, Сіань, Китай
  • 3 Школа медицини, Шанхайський університет Цзяо Тонг, Шанхай, Китай
  • 4 кафедри анестезіології, медицини та фізіології, Медичний факультет Девіда Геффена при Університеті Каліфорнії, Лос-Анджелес, Лос-Анджелес, Каліфорнія, США

Вступ

За останні кілька років інсулінорезистентність та діабет були пов'язані з порушеним гомеостазом амінокислот з розгалуженими ланцюгами (BCAA) у ожирілих тварин та людей (Lynch and Adams, 2014). BCAA, включаючи лейцин, ізолейцин та валін, є незамінними амінокислотами. Ряд спостережних досліджень показав, що підвищений рівень циркулюючих BCAA пов'язаний із цукровим діабетом 2 типу (T2DM) та резистентністю до інсуліну у людей та деяких моделей гризунів (Shaham et al., 2008; Huffman et al., 2009; Tai et al., 2010; Xu et al., 2013; Lynch and Adams, 2014; Lian et al., 2015). Довгі та перспективні дослідження в різних когортах показали, що підвищення рівня BCAA в крові є прогностичним для патогенезу діабету, а зміна рівня BCAA у плазмі є прогностичним для результатів втручання при цукровому діабеті (Wang et al., 2011; Melnik, 2012; Wang-Sattler et al. ., 2012; Floegel et al., 2013; Lu et al., 2013; McCormack et al., 2013). Нижчий рівень BCAA асоціюється з поліпшенням інсулінорезистентності після інтервенційних процедур (Laferrere et al., 2011; Wang et al., 2011; Shah et al., 2012). Чітка асоціація призвела до припущень про потенційну причинну роль порушеного гомеостазу BCAA в T2DM (Lynch and Adams, 2014).

Гомеостаз амінокислот з розгалуженими ланцюгами визначається значною мірою їх катаболічною активністю в тканинах. Перші два етапи катаболізму BCAA поділяють усі три BCAA. Початкова стадія дезамінування для отримання кетокислот з розгалуженим ланцюгом (BCKA) каталізується трансаміназами BCAA (BCAT), після чого відбувається окисне декарбоксилювання з утворенням складних ефірів CoA, реакція, що каталізується комплексом BCKA дегідрогенази (BCKD). Комплекс BCKD є ферментом, що обмежує швидкість катаболізму BCAA, і жорстко регулюється інгібуючим фосфорилюванням BCKDK та активує дефосфорилювання мітохондріальною фосфатазою 2C (PP2Cm). Втрата PP2Cm в генетичній моделі частково погіршує катаболізм BCAA, що призводить до вищих концентрацій BCAA та BCKA у плазмі крові (Lu et al., 2009). Подібним чином у ожирілих тварин і людей катаболічні гени BCAA регулюються вниз, а катаболізм BCAA є помірно дефектним, сприяючи підвищенню рівня BCAA та BCKA у плазмі (She et al., 2007b, 2013; Pietiläinen et al., 2008; Herman et al., 2010; Lackey et al., 2013; Lu et al., 2013; Menni et al., 2013; Zimmerman et al., 2013).

Сильний зв'язок між підвищеним рівнем BCAA та асоційованим із ожирінням T2DM свідчить про те, що порушений гомеостаз BCAA може сприяти дисфункціональному глікемічному контролю. Дійсно, останні дослідження показують, що катаболічний дефект BCAA сприяє ожирінню асоційованої резистентності до інсуліну та діабету (White et al., 2018; Zhou et al., 2019). Однак у ожирених тварин і людей порушення регулювання ліпідного обміну та інших процесів різко впливає на чутливість до інсуліну та метаболізм глюкози. Таким чином, залишається складним відрізнити акуратний вплив катаболічного дефекту BCAA на метаболізм глюкози від порушення ожиріння у ожирілих тварин. Використовуючи худих мишей, поточне дослідження досліджує вплив катаболічного дефекту BCAA на метаболічні процеси глюкози в генетичній моделі миші, в якій абляція PP2Cm частково погіршує катаболізм BCAA.

Матеріали і методи

Тварини

Миші дикого типу C57BL/6 та PP2Cm, що нокаутували, миші, що відповідають віку, знаходились на одному генетичному тлі та утримувалися в одному приміщенні. Миші-нокаути зародкової лінії PP2Cm генерували, як описано раніше (Lu et al., 2009). Всіх тварин (у віці 10–14 тижнів) утримували при 22 ° C з 12-годинним світловим та 12-годинним темним циклом із вільним доступом до води та стандартним чау. Усі процедури на тваринах проводились відповідно до керівних принципів та протоколів, затверджених Комітетом з гуманного поводження з тваринами при Шанхайській медичній школі Університету Цзяо Тонг або Університетом Каліфорнії в Лос-Анджелеському інституційному комітеті з догляду та використання тварин.

Непрямі вимірювання калориметрії

Вимірювання споживання кисню (VO2) та вироблення вуглекислого газу (VCO2) за допомогою непрямої калориметрії проводили при температурі навколишнього середовища, використовуючи Комплексну лабораторну систему моніторингу тварин (CLAMS, Columbus Instruments, OH, США) згідно з інструкціями виробника. Коефіцієнт дихального обміну (RER) дорівнює [обсягам вивільненого СО2]/[обсягу споживаного O2]. Самців мишей приймали в КЛАМ з вільним доступом до їжі та води і дозволяли їм акліматизуватися в окремих метаболічних клітинах протягом 48 годин до будь-яких вимірювань, а дані збирали протягом наступних 36 годин.

Тест на толерантність до глюкози та інсуліну

Самці мишей голодували протягом 6 год, починаючи з 8 ранку. Для тесту на толерантність до інсуліну мишам вводили інтраперитонеально інсулін (0,75 ОД/кг маси тіла; Sigma, США). Для тесту на толерантність до глюкози мишам вводили внутрішньочеревно D-глюкозу (1,5 г/кг маси тіла; Sigma, США). Концентрацію глюкози в крові вимірювали за допомогою портативного глюкометра (Johnson & Johnson, США) через хвостову кровотечу у часи, вказані після ін’єкції.

Виділення РНК та qRT-ПЛР

Загальну РНК виділяли з тканин або клітин за допомогою тризолу (Invitrogen, США). Загальна РНК (2 мкг) була зворотно транскрибована з використанням випадкових праймерів та MMLV (Promega, США). Кожен зразок кДНК аналізували за допомогою ПЛР-системи Apm Biosystems Prism7900HT у реальному часі, використовуючи Absolute SYBR Green (ABI, США) з наступними послідовностями праймерів:

миша PYGL_R: 5′CTTGACCAGAGTGAAGTGCAG 3 ′.

Метаболомічний аналіз

Культура клітин

Клітини HepG2 культивували в модифікованому Дульбекко середовищі Eagle (Hyclone, Пекін), доповненому 10% плодовою бичачою сироваткою (FBS, Sigma), пеніциліном (100 IU/мл) і стрептоміцином (100 μg/мл) у зволоженому 5% CO2-95 % повітряного інкубатора при 37 ° C. Для стимуляції BCAA (800 мкМ) або BCKA (400 мкМ) клітини інкубували в безсироватковому DMEM протягом 12 годин, а потім інкубували в DMEM без BCAA протягом 1 години до початку 12-годинних процедур. BCAA та BCKA розбавляли у DMEM без BCAA. Спеціальна DMEM без BCAA була надана компанією Invitrogen. Хімічні речовини BCAA та BCKA були придбані у Sigma.

Мітохондріальний аналіз

Виділення мітохондрій для вимірювання споживання кисню проводили, як було описано в іншому місці (Korge et al., 2011). Коротко кажучи, мітохондрії виділяли з тканин, а споживання кисню вимірювали за допомогою волоконно-оптичного спектрофлуорометра Ocean Optics. Мітохондрії (0,25 мг/мл) додавали до буфера для аналізу (125 мМ KCl, 10 мМ HEPES-KOH, рН 7,4). Концентрацію кисню в буфері постійно реєстрували за допомогою волоконно-оптичного датчика кисню Ocean Optics FOXY. Піруват, малат та глутамат додавали у вигляді вільних кислот, забуференних Tris (pH 7,4), для аналізу активності комплексу I. Сукцинат використовували для аналізу активності комплексу II у присутності ротенону (1 мкМ). Додавання 0,2 мМ ADP ініціювало споживання кисню. Суміш NaCl або BCKA-Na додавали до реакційної системи після споживання першого імпульсу АДФ. Потім був доданий другий імпульс АДФ. Швидкість споживання кисню (OCR) розраховували з кожним додаванням ADP. Відносну швидкість споживання кисню розраховували шляхом ділення OCR другого імпульсу АДФ на ОКР першого імпульсу АДФ. Представлені дані представляли середні значення трьох незалежних експериментів.

Статистика

Якщо не вказано інше, статистичний аналіз проводився за допомогою двостороннього дослідження Стьюдента т-тест або двосторонній ANOVA, а потім Бонферроні post hoc тест (тести на допуск), де це доречно, за допомогою GraphPad Prism. Дані розраховували як середнє значення ± SEM. A стор-значення менше 0,05 вважалося статистично значущим.

Результати

Фізіологічна характеристика худих мишей з катаболічним дефектом BCAA

Фігура 1. Катаболічний дефект амінокислот з розгалуженою ланцюгом (BCAA) зменшує масу тіла, благотворно впливаючи на метаболізм глюкози у мишей PP2Cm KO. Вага тіла (A, n = 10–11), споживання їжі (B, n = 10–11), коефіцієнти дихального обміну (RER) (C., n = 9/генотип), середній коефіцієнт корисної реакції протягом світлих та темних циклів (D, n = 9/генотип), тест на толерантність до глюкози (E, G) та тест на толерантність до інсуліну (F, H) WT і PP2Cm KO мишей-самців годували нормальним харчуванням (n = 8 для кожної групи). Дані представлені як середні значення ± SEM. ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗ P ∗ стор ∗∗ стор ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор ∗ стор ∗∗ стор ∗ стор ∗∗ стор ∗ стор Ключові слова: амінокислоти з розгалуженими ланцюгами, метаболізм глюкози, катаболічний дефект, худі миші, печінка

Цитування: Wang J, Liu Y, Lian K, Shentu X, Fang J, Shao J, Chen M, Wang Y, Zhou M and Sun H (2019) BCAA Catabolic Defect змінює метаболізм глюкози у худих мишей. Спереду. Фізіол. 10: 1140. doi: 10.3389/fphys.2019.01140

Отримано: 07 червня 2019 р .; Прийнято: 20 серпня 2019 р .;
Опубліковано: 04 вересня 2019.

Катя Аквілано, Римський університет Тор Вергата, Італія

Марсія Кейроз Латорка, Федеральний університет імені Мату-Гросу, Бразилія
Еверардо Магалхаес Карнейро, Державний університет Кампінасу, Бразилія

† Ці автори зробили однаковий внесок у цю роботу