Метаболомічний аналіз діабету, викликаного дієтою, діабету 2 типу із використанням UPLC/MS, інтегрованого з підходом до розпізнавання образів

Афілійований відділ фармацевтичного аналізу, Ключова лабораторія метаболоміки та хінмедомії, Національна лабораторія фармакохімії сироватки крові TCM, Університет китайської медицини Хейлунцзян, Харбін, Китай

Хуей Сонце,
Шусян Чжан,
Айхуа Чжан,
Гуанлі Янь,
Сюхон Ву,
Ін Хань,
Сіджунь Ван

Цифри

Анотація

Метаболоміка представляє нову дисципліну, що стосується всебічної оцінки ендогенних метаболітів малих молекул у біологічних системах та забезпечує потужний підхід до розуміння механізмів захворювань. Діабет 2 типу (T2D), який називають тягарем 21 століття, зростає зі швидкістю епідемії. Однак його точний молекулярний механізм не був всебічно досліджений. У цьому дослідженні ми застосували метаболоміку сечі на основі UPLC/MS, інтегровану з підходами до розпізнавання образів, для виявлення диференціюючих метаболітів, для характеристики та дослідження порушення метаболічного шляху в експериментальній моделі для T2D, спричиненого дієтою з високим вмістом жиру. Шість диференціюючих метаболітів сечі було виявлено в негативному режимі, і два (2- (4-гідрокси-3-метокси-феніл) ацетальдегід сульфат, 2-фенілетанол глюкуронід) з яких були виявлені за участю ключових метаболічних шляхів, пов’язаних з взаємоперетвореннями пентози та глюкуроната., крохмалю, метаболізму сахарози та тирозину. Наше дослідження дає нове розуміння патофізіологічних механізмів і може покращити розуміння патогенезу T2D.

Цитування: Sun H, Zhang S, Zhang A, Yan G, Wu X, Han Y, et al. (2014) Метаболомічний аналіз діабету, викликаного дієтою, діабету 2 типу із використанням UPLC/MS, інтегрованого з підходом до розпізнавання образів. PLoS ONE 9 (3): e93384. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0093384

Редактор: Даніель Монлеон, Instituto de Investigación Sanitaria INCLIVA, Іспанія

Отримано: 9 серпня 2013 р .; Прийнято: 4 березня 2014 р .; Опубліковано: 26 квітня 2014 р

Фінансування: Ця робота була підтримана грантами Державної фундації державного фонду природничих наук (грант № 90709019), Національної програми досліджень та розвитку ключових технологій Міністерства науки і технологій Китаю (грант № 2011BAI03B03, 2011BAI03B06, 2011BAI03B08), Ключова науково-технічна програма провінції Хейлунцзян, Китай (грант № GC06C501, GA08C303, GA06C30101), Фонд університету китайської медицини Хейлунцзян (грант № 201209) та національний ключовий предмет інновацій в галузі наркотиків (грант № 2009ZX09502-005) . Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Можна припустити, що у метаболоміків у осіб з T2D багато метаболічних шляхів можуть бути порушені і, мабуть, відіграють роль у їх загальній метаболічній дисфункції. Таким чином, ідентифікація нових біомаркерів та шляхів може поліпшити характеристику патофізіологічних змін, пов’язаних з T2D [6]. Розуміння біохімічних мереж допоможе прояснити етіологію діабету та повинно сприяти відкриттю нових біомаркерів ризику та тяжкості захворювання. Раніше ми повідомляли про аналіз цільової кількісної метаболоміки, де ми показали, що багато відомих та нових спостережень за метаболічними змінами можуть бути виявлені за допомогою такого підходу до метаболоміки [7] - [10]. Метод має можливість виявляти збурення метаболічного гомеостазу в організмі і тим самим пропонує доступ до маркерів метаболічних шляхів, на які впливає захворювання [11] - [13]. Застосовуючи цей комплексний підхід до біохімічного профілювання, ми прагнемо виявити метаболіти з різною концентрацією в T2D і тим самим дати нові уявлення про патофізіологічне прогресування цього важливого метаболічного захворювання.

Різні аналітичні методи з використанням багатовимірного аналізу даних, такі як частковий дискримінантний аналіз найменших квадратів (PLS-DA), застосовувались у дослідженнях метаболізму на основі метаболоміки [14]. UPLC, поєднаний з MS, став одним із широко застосовуваних методів у метаболоміці завдяки високій чутливості та відтворюваності [15] - [20]. Тут досліджували метаболоміку сечі на основі UPLC-MS для дослідження метаболічних профілів та потенційних біомаркерів у моделі T2D щурів, що може полегшити розуміння патологічних змін T2D та отримати систематичний погляд на розкриття механізмів T2D.

Матеріали і методи

Хімічні речовини та реактиви

Ацетонітрил (сорт ВЕРХ) був придбаний у компанії Dikma Technology Inc. (компанія Dima, США). Деіонізовану воду очищали системою Milli-Q (Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США). Мурашина кислота (сорт ВЕРХ, FA) була придбана у компанії «Медвелл» (США). Лейциновий енкефалін був придбаний у Sigma-Aldrich (MO, США). Емульсію з високим вмістом жиру приготувала наша лабораторія. Коротко, сало 20 г, метилтіоурацил 1 г, холестерин 5 г, глутамат натрію 1 г, цукор 5 г, фруктоза 5 г, пропіленгліколь 30 мл змішували і додавали об’єм води до 100 мл і готували до емульсії з високим вмістом жиру (див. Посилання 21).

Заява про етику

Наше дослідження було проведено в суворій відповідності з рекомендаціями Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин Хейлунцзянського університету китайської медицини. Протокол був схвалений Комітетом з етики експериментів на тваринах Хейлунцзянського університету китайської медицини (номер дозволу: CEAE-HUCM-0126104). Всі зусилля були зроблені, щоб мінімізувати страждання.

Поводження з тваринами

Збір та підготовка зразків

Усі щури кожної групи утримувались у метаболічних клітинах (по 1 на клітку). Сечу збирали щодня (о 6:00 ранку) з клітин з метаболізмом при температурі навколишнього середовища протягом усієї процедури і центрифугували при 13000 об/хв при 4 ° C протягом 5 хв, а супернатанти зберігали замороженими при -80 ° C до аналізу. Всі ці зразки перед аналізом розморожували при кімнатній температурі та центрифугували при 13000 об/хв протягом 5 хв. Аликвоту 5 мкл вводили для аналізу UPLC/MS після фільтрування через мембранний фільтр 0,22 мкм.

Метаболічне профілювання

Хроматографія.

UPLC/ESI-Q-TOF/MS використовували для глобального аналізу зразків сечі. Хроматографічний аналіз проводили в системі Waters ACQUITY UHPLC, керованій Masslynx (V4.1, Waters Corporation, Мілфорд, США). Аликвоту 6 мкл розчину зразка вводили на колонку ACQUITY UPLC BEH C18 (50 мм × 2,1 мм, 1,7 мкм, Waters Corporation, Мілфорд, США) при 35 ° C, швидкість потоку становила 0,5 мл/хв, і впорскували об'єм становив 2 мкл. Оптимальна рухлива фаза складалася з лінійної градієнтної системи (А) 0,1% мурашиної кислоти у воді та (В) 0,1% мурашиної кислоти в ацетонітрилі, 0–1 хв, 99–90% А; 1–4 хв, 90–80% А; 4–6 хв, 80–65% А; 6–9 хв, 65-1% А; 9–11 хв, 1% А; 11–11,5 хв, 1–99% А, 11,5–13 хв, 99% А. Крім того, зразок QC використовували для оптимізації стану UPLC-Q-TOF/MS, оскільки він містив більшість інформації про зразки цільної сечі . Зразок контролю якості проводили кожні 6 зразків сечі для оцінки стабільності під час аналізу послідовності. Щоразу, коли закінчувалася одна ін’єкція зразка, проводився цикл промивання голки для видалення залишків та підготовки до наступної проби. Крім того, елюенти передавали в мас-спектрометр безпосередньо, тобто без розщеплення.

Мас-спектрометрія

Мас-спектрометрію експлуатували методом електророзпилювальної іонізації в режимі негативної іонізації. Елюент вводили в мас-спектрометр високої чіткості (Waters Corp., Мілфорд, США), і оптимальні умови аналізу були такими: температура джерела була встановлена на 110 ° C, температура газу розчинення становила 350 ° C, витрата конусного газу становив 50 год, потік газу, що розчинявся, становив 600 л/год; напруга капіляра становила 2,3 кВ, напруга конуса для відбору проб - 35 В, напруга мікроканалу на пластині - 2450 В, напруга конуса вилучення - 3,0 В. Швидкість збору даних встановлена на 0,14 с/сканування, із затримкою між скануванням 0,1 с. Дані збирали в центроїдному режимі від 100 до 1000 Да. Для точного набору маси використовували блокувальну масу лейцин-енкефаліну в концентрації 0,2 нг/мл через інтерфейс блокування розпилення при швидкості потоку 100 мкл · хв-1, контролюючи режим негативних іонів ([M + H] - = 556,2615) для забезпечення точності під час аналізу MS.

Багатовимірний аналіз та обробка даних

Сирі дані UPLC-MS були імпортовані в програмне забезпечення MassLynx ™ (Waters Corp.) для виявлення та вирівнювання піків. Інтенсивність кожного іона нормалізували щодо загальної кількості іонів, щоб сформувати матрицю даних, яка складалася з часу утримання, значення m/z та нормалізованої площі піку. Багатовимірна матриця даних була проаналізована за допомогою програмного забезпечення EZinfo 2.0 (Waters Corp., Мілфорд, США). Усі змінні були паретомасштабні до PLS-DA. Тут PLS-DA використовувались для обробки отриманих даних UPLC-MS. При моделюванні PLS-DA ендогенні метаболіти, що сприяють класифікації, були виявлені на навантажувальних ділянках, що показало важливість кожної змінної для класифікації. T-тест Стьюдента проводили для виявлення особливостей з різним вмістом у різних групах.

Ідентифікація метаболічного шляху

Цікаві біомаркери були вилучені із ділянок завантаження PLS-DA на основі їх внеску у варіацію та кореляцію в межах набору даних. Що стосується ідентифікації потенційних біомаркерів, то спектр іонів відповідав структурному повідомленню метаболітів, отриманих з біохімічних баз даних, таких як HMDB, http://www.hmdb.ca/; KEGG, http://www.genome.jp/kegg/; METLIN, http://metlin.scripps.edu/; Хімічні об'єкти, що представляють біологічний інтерес (http://www.ebi.ac.uk/Databases/); MassBank, http://www.massbank.jp/; Центр масової спектрометрії Скриппса (http://masspec.scripps.edu/index.php) та Lipidmaps (http://www.lipidmaps.org/). Реконструкцію та аналіз шляхів потенційних біомаркерів проводили за допомогою програмного забезпечення MetPA, заснованого на джерелі бази даних.

Результати

Багатовимірний статистичний аналіз сечі щурів

Біохімічні параметри контрольної групи та групи T2D були зведені в таблицю 1. Біохімічні результати, що спостерігались у групі T2D, показали значну різницю порівняно з контрольною групою. У цьому дослідженні було встановлено і застосовано метод PLS-DA для виявлення біомаркерів, які були пов’язані з розвитком T2D. Як показано на рис. 1, існує чітка класифікація між кластеризацією контрольної та T2D-груп. За результатами S-графіку загалом 6912 змінних іонів (рис. 2) суттєво відрізнялись між контрольною та модельною групами. Нарешті, 6 з них у негативному режимі були ідентифіковані шляхом пошуку MS та фрагментів MS/MS у базі даних метаболітів, і нарешті підтверджено комерційними стандартами (таблиця S1).

Зразки сечі від контрольної групи та щурів групи T2D піддавали UPLC/MS. Потім модель PLS була використана для створення навантаження S-графіку, що показує іони, важливі для кластеризації зразків. Точки даних вказують на те, що іони найбільш відповідальні за дисперсію в бальній шкалі.

Визначення кандидатів на метаболіт

Інформація, включаючи час утримання, точну масу та дані мс/мс, забезпечувалась надійною платформою UPLC-MS. Точну молекулярну масу визначали в межах розумного ступеня похибки вимірювання за допомогою Q-TOF, а також отримували потенційний склад елементів, ступінь ненасиченості та фракційну ізотопність сполук. Ідентифікацію метаболітів проводили за допомогою фрагментів MS та MS/MS з високою роздільною здатністю, а також аналіз бази даних. Ми шукали передбачувану молекулярну формулу в ChemSpider, Базі даних метаболомів людини, KEGG та Базі даних малих молекул, щоб підтвердити можливі хімічні склади. Відповідно до протоколу, описаного вище, було виявлено шість ендогенних метаболітів та узагальнено в таблиці S1.

Мережа біомаркерів та реконструкція метаболічних шляхів

Пов’язані шляхи біомаркерів досліджували шляхом пошуку за KEGG та HMDB, і було створено мережу деяких біомаркерів. Аналіз метаболічних шляхів за допомогою MetPA показав, що потенційні біомаркери в основному беруть участь у взаємозв'язку пентози та глюкуронату, метаболізмі крохмалю та сахарози та метаболізмі тирозину, які особливо змінилися в умовах T2D (рис.3). Два різні метаболіти (2-фенілетанол глюкуронід, 2- (4-гідрокси-3-метокси-феніл) ацетальдегід сульфат), виявлені за цими шляхами, брали участь у розвитку T2D, що вказувало на те, що дисфункція мульти-шляхів була залучена в патологічний процес T2D. Детальна побудова шляхів метаболізму з вищими балами показана на рис.3. Результати дозволяють припустити, що ці цільові шляхи показували помітні збурення з плином часу T2D і могли сприяти розвитку T2D.

Визначення мережевого шляху за допомогою програмного забезпечення MetPA (A). Путативні метаболічні шляхи взаємоперетворень пентози та глюкуронату (B), метаболізму крохмалю та сахарози (C) та метаболізму піримідину (D) визначали із сечі щурів проміжних продуктів під час метаболізму речовин. Карта була сформована за допомогою контрольної карти KEGG. Червоний колір позначає уражені метаболіти, пов’язані із шляхами. a, 2-фенілетанол глюкуронід; b, 2- (4-гідрокси-3-метокси-феніл) ацетальдегід сульфат.

Обговорення

Метаболоміка - це швидко розвивається дисципліна, що передбачає систематичне вивчення ендогенних малих молекул, що характеризують шляхи метаболізму біологічних систем [23]. Він широко вивчався у захворюваннях людини і призвів до значного прогресу в розумінні патофізіології хвороб. Цукровий діабет є однією з найважливіших проблем зі здоров'ям у світі, і приблизно 90% хворих на цукровий діабет страждають на СД2, і його частота залишається найвищою у світі [24]. На щастя, метаболоміка представила нові уявлення про патологію діабету, а також методи прогнозування початку захворювання та виявила нові біомаркери. Нещодавно було розроблено різноманітні біомаркери, що відображають патології T2D, щоб отримати нові уявлення про метаболічні шляхи та патофізіологічні механізми [25]. Оскільки деякі з вищевказаних процесів можуть призвести до метаболічних «сигнатур» у сечі, що було б корисно для діагностики T2D, а також для терапевтичної реакції. Незважаючи на те, що докладено великих зусиль для розкриття складних молекулярних механізмів, що використовуються в патогенезі хвороби T2D, залишається задовільне пояснення.

Висновки

Широко застосовуються нові високопродуктивні технології метаболоміки, спрямовані на відкриття біомаркерів-кандидатів на захворювання та можуть допомогти зрозуміти механізм виникнення T2D на метаболічному рівні. Тут ми ілюструємо, як метаболоміку можна використовувати для дослідження механізмів T2D, які впливають на різні «ключові шляхи». T2D є однією з найпоширеніших хвороб у світі, але в даний час важко визначити точну патофізіологію. Тут ми застосували підхід метаболоміки на основі UPLC/MS для систематичного дослідження T2D. Цікаво, що за даними аналізу шляхів винахідливості було виявлено 3 різні шляхи, такі як взаємоперетворення пентози та глюкуронату, метаболізм крохмалю та сахарози, метаболізм тирозину тощо. На основі наших висновків припускається, що підхід метаболоміки є високоефективним у сприянні ідентифікації T2D за допомогою біомаркерів. Безперервне, динамічне та неінвазивне виявлення метаболітів у сечі щурів T2D було успішно продемонстровано і збільшить наше розуміння патофізіологічних процесів та допоможе нам виявити потенційні біомаркери для розробки нових терапевтичних стратегій.

Довідкова інформація

Таблиця S1.

Список потенційних біомаркерів сечі зразків сечі від діабету 2 типу.