Кріоконсервація жирової тканини

Анотація

Головною перешкодою на шляху досягнення сприятливого результату збільшення м’яких тканин після трансплантації аутологічного жиру є непередбачувані довгострокові результати через високу швидкість всмоктування в прищепленому місці. В даний час жирові аспірати можна використовувати лише для негайного аутологічного жирування під час тієї самої процедури, в якій проводиться ліпосакція; тому жирові аспірати, отримані в результаті процедури, як правило, викидають. як сильним бажанням як хірургів, так і пацієнтів було можливість зберегти жирові аспірати, якщо б існувала оптимальна техніка, для потенційних застосувань у майбутньому. Протягом останніх кількох років кріоконсервація жирової тканини широко вивчалася в лабораторії автора. Кілька висновків цього захоплюючого поступального дослідження призведуть до розробки надійного методу довгострокового збереження жирової тканини в майбутньому. крім того, успішне тривале збереження жирової тканини може відкрити нову еру в регенерації тканин, пов’язаних із жировою тканиною.

Аутологічна трансплантація жиру (AFT) в косметичній та реконструктивній пластичній хірургії зробила революцію в хірургічному лікуванні збільшення м’яких тканин обличчя, рук чи інших частин тіла протягом останнього десятиліття. Оскільки ліпосакція набула популярності останнім часом, джерело прищеплених матеріалів для АФТ слід переглянути. Жирові аспірати, отримані в результаті ліпосакції, мають багато властивостей, бажаних для збільшення м’яких тканин, оскільки вони рясні, легко доступні, недорогі, сумісні з господарями, і їх можна збирати легко і багаторазово. 1 Дотепер головною перешкодою на шляху досягнення сприятливого результату збільшення м’яких тканин після АФТ є його непередбачувані довгострокові результати завдяки високій швидкості всмоктування (до 70% від початкового введеного об’єму) в прищепленому місці. 2 Цей високий рівень абсорбції часто вимагає надмірної корекції або повторних процедур у бажаній області, що спричиняє дискомфорт пацієнта, менше оптимального зовнішнього вигляду, високу вартість та захворюваність або травмування донорських ділянок. 1, 2

В даний час жирові аспірати можна використовувати лише для негайного аутологічного жирування під час тієї самої процедури, в якій проводиться ліпосакція; тому жирові аспірати, отримані в результаті процедури, як правило, викидають. Як пластичні хірурги, так і пацієнти мали сильне бажання зберегти жирові аспірати, якщо б існувала оптимальна техніка, для потенційних майбутніх застосувань. З урахуванням рівня досконалості пластичні хірурги сподіваються на хірургічні результати, і можливість збереження та накопичення раніше зібраних жирових тканин для можливого подальшого використання або багаторазового застосування користується великим попитом.

У цьому огляді автор резюмує попередні дослідження з кріоконсервації жирової тканини, розробку протоколу кріоконсервації жирової тканини та результати кількох останніх досліджень. Крім того, будуть обговорені перспективи цієї існуючої галузі трансляційних досліджень.

Попередні дослідження з кріоконсервації жирової тканини

Донедавна лише кілька емпіричних експериментальних досліджень вивчали роль замороженого сховища для короткочасного збереження жирових аспіратів, отриманих ліпосакцією, при відносно високій температурі (від + 1 ° C до -18 ° C). В одному дослідженні жирова тканина людини, отримана за допомогою ліпосакції, зберігалась у побутовому холодильнику при -18 ° C протягом 2 тижнів. Після розморожування жир вводили голим мишам. У контрольній групі жир вводили відразу після збирання. Введений жир вижив як у досліджуваній, так і в контрольній групах. Не було виявлено суттєвих відмінностей між групами у вазі, обсязі жирової тканини або гістології. 3 В іншому дослідженні комерційно доступне холодильне або морозильне обладнання використовувалось для зберігання відібраного всмоктуваного автологічного підшкірного жиру щурів Спраг-Доулі. Аспірований жир зберігався при -16 ° C (заморожений) або 1 ° C (у холодильнику) протягом 1 або 2 тижнів, а потім підшкірно імплантували щурам. Гістологічне порівняння чітко продемонструвало зменшення життєздатних адипоцитів та збільшення ознак запалення та некрозу жиру у тих тварин, які отримували збережений жир, порівняно з негайною імплантацією жиру. 4 Ці зміни стають більш суворими із збільшенням тривалості зберігання та використанням холодильника при заморожуванні.

У нашій лабораторії було проведено попереднє дослідження, щоб оцінити вплив та роль лише температури для зберігання жирової тканини. У цих дослідженнях життєздатність жирових аспіратів оцінювали за допомогою аналізу гліцерол-3-фосфатдегідрогенази (G3PDH) при 4 ° C і -20 ° C. Через 2 тижні зберігання життєздатність жирових аспіратів знизилася приблизно на 80% при 4 ° C. Однак життєздатність жирових аспіратів знизилася лише на приблизно 5% при −20 ° C. Крім того, спочатку була проведена серія експериментів з різними типами та концентраціями кріозахисних речовин та їх різними комбінаціями, щоб визначити, який найкращий кріозахисний засіб може застосовуватися, особливо для жирових тканин. Під час попередніх досліджень також було оцінено ряд протоколів заморожування та розморожування жирової тканини. 10

Хоча кілька досліджень показали обнадійливі попередні результати для кріоконсервації аутологічних жирових трансплантатів для можливого подальшого застосування, методика, описана в дослідженні, може використовуватися лише для короткочасного збереження (кілька днів або тижнів) і може бути не оптимальною через неконтрольовану процес охолодження/нагрівання та відсутність використання кріозахисного агента. Застосовуючи сучасні методи кріоконсервації, можна досягти кращого тривалого збереження жирових тканин. Такий метод, ймовірно, дозволить зберігати жирові трансплантати протягом місяців або років (нижче -85 ° C) або більше 10 років (при -196 ° C у рідкому азоті).

Розробка протоколу кріоконсервації жирових трансплантатів

Сучасні методики кріоконсервації.

Сучасна техніка кріоконсервації дозволяє довго зберігати живі клітини та тканини, які можуть мати багато потенційних клінічних застосувань, таких як переливання крові, трансплантація кісткового мозку, запліднення in vitro, судинні трансплантати, кісткові трансплантати та шкірні трансплантати. 11 Основні етапи процесу кріоконсервації можна узагальнити наступним чином: (1) додати кріопротекторні речовини до клітин/тканин перед охолодженням, (2) охолодити клітини/тканини з контрольованою швидкістю до низької температури, при якій клітини/тканини зберігаються, (3) нагріти клітини/тканини та (4) видалити кріозахисні речовини з клітин/тканин після розморожування. 12 Оптимальна швидкість охолодження для виживання клітин повинна бути досить повільною, щоб уникнути утворення внутрішньоклітинного льоду, але досить швидко, щоб мінімізувати пошкодження клітини.

Вибір кріозахисних засобів.

Встановлення протоколу заморожування та розморожування.

Протокол заморожування та розморожування, описаний у цьому документі, являє собою найкращий із можливих методів, розроблених для кріоконсервації жирової тканини, і був використаний у наших подальших дослідженнях. 14 - 16 Свіжі жирові аспірати після приготування поміщали у флакон і змішували з об'єднаним розчином ДМСО (в 0,5 молярі) та розчином трегалози (в 0,2 молярі) у співвідношенні один до одного. Після додавання кріопротекторних засобів флакон поміщали при кімнатній температурі на 10 хвилин, а потім поміщали у метанольну ванну (Kinetics, Stone Ridge, NY). Система заморожування була запрограмована на охолодження при температурі 1∼2 ° C на хвилину від 22 ° C до −30 ° C без утворення штучного льоду. Потім флакон переносили в рідкий азот (-196 ° C) після досягнення -30 ° C для тривалого збереження.

Перед розморожуванням флакон, що містить кріоконсервовані жирові аспірати, виймали з резервуара для рідкого азоту і поміщали при кімнатній температурі на 2 хвилини, щоб випускати пари рідкого азоту з флакона. Потім флакон опускали на водяну баню з перемішуванням до 37 ° C, поки збережені жирові аспірати не були ретельно розморожені.