Конструювання дріжджів з низьким вмістом етанолу та вина шляхом часткового видалення Saccharomyces cerevisiae PDC2 ген

Анотація

Вступ

Матеріали і методи

Штами, середовища та умови зростання

Saccharomyces cerevisiae лабораторні штами BY4741 (гаплоїдні, МАТ a ; his3Δ 1; leu2Δ 0; met15Δ 0; ura3Δ 0) і BY4743 (диплоїдні, МАТ a / МАТ α his3Δ 1/his3Δ 1; leu2Δ0/leu2Δ 0; met15Δ 0/MET15; LYS2/lys2Δ 0; ura3Δ 0/ura3Δ 0) використовувались для побудови мутантів та як контрольних штамів під час експериментів з вініфікацією. Для тестування використовували комерційні винні дріжджі EC1118 (Лаллеманд, Данія) та штатний штам Mab2C, попередньо відібраний у нашій лабораторії. pdc2Δ519 мутація в природних генетичних походженнях. Всі дріжджові штами вирощували при 30 ° C та 150 об/хв у середовищі YPD (2% глюкози, 2% пептону та 1% дріжджового екстракту). YPD, доповнений 200 мг/л G-418, використовували для відбору та обслуговування трансформантів.

Побудова та геномна інтеграція pdc2Δ344 і pdc2Δ519 мутації

Криві зростання в середовищі, багатому на YPD

Дріжджові культури інокулювали в 10 мл YPD і вирощували протягом ночі. Потім ці культури використовували для інокуляції 50 мл YPD у 100 мл колби Ерленмейера при початковій OD600 0,2 (спектрофотометр УФ-видимий T60U PG Instruments, Лестершир, Великобританія). Культури вирощували зі 150 об/хв при 30 ° C, а аликвоти по 100 мкл брали з різними інтервалами для вимірювання OD600.

Лабораторні вініфікації

Статистичний аналіз даних

Тест ANOVA та LSD Фішера зі значенням $ $>> = D ^> \ ліво \> \ ліворуч [\ ліворуч ((\ upmu _> * e)/D \ праворуч) * (\ лямбда-t) +1 \ праворуч ] \ праворуч \> $$

де y = ln (ODt/OD0) OD0 - початковий OD і ODt - OD в момент часу t; D = ln (ODmax/DO0) - максимальна асимптотична крива, μmax - максимальна питома швидкість росту (1/год), λ - період фази відставання (год). Дані про зростання та кінетику встановлювали за допомогою нелінійної процедури регресії, мінімізуючи суму квадратів різниці між експериментальними даними та встановленою моделлю.

Результати

Зростання гаплоїдного та диплоїдного pdc2Δ519 і pdc2Δ344 мутанти в аеробних умовах

Зростання батьківських та мутантних лабораторних штамів у YPD при 30 ° С та струшуванні 150 об/хв. Кожна точка представляє середнє значення двох незалежних культур

Кількісне визначення параметрів бродіння на основі лабораторних вініфікацій та відбір низького вмісту етанолу pdc2 мутанти

Для того, щоб вибрати низький вміст етанолу pdc2 мутантних штамів, ми провели серію мікровініфікацій з концентрованим суслом, розведеним до 20 ° Bx і доповненим 0,1% (мас./об.) дріжджового екстракту (Vazquez et al. 2001). Визначали концентрацію етанолу, оцтової кислоти, гліцерину та залишкового цукру та розраховували інші похідні ферментативні параметри, такі як баланс вуглецю та вихід глюкози. Ми шукали мутантний штам з незначною неефективністю для отримання етанолу, щоб зменшити вміст алкоголю у вині від 1 до 2% (об/об). Під час першого експерименту з вініфікацією (V1) гаплоїдні та диплоїдні pdc2Δ519 мутанти аналізували на відповідні контролі BY4741 та BY4743 (таблиця 1). Враховуючи виробництво етанолу, BY4741pdc2Δ519 не показав статистичної різниці порівняно з контролем, тоді як BY4743pdc2Δ519 показали статистично значуще зниження етанолу (стор Таблиця 1 Параметри ферментації в лабораторних аналізах вініфікації в білій суслі 20 ° Bx батьківськими та мутантними лабораторними штамами дріжджів

Більшість зусиль, спрямованих на відхилення потоку вуглецю від етанолу, зосереджуються на виробництві гліцерину, бажаного вторинного метаболіту бродіння. Отже, також вимірювали гліцерин, вироблений у лабораторних вініфікаціях (табл. 1). Кількісна оцінка гліцерину може дати підказку того, що відбувається з потоком вуглецю в pdc2Δ мутанти, зокрема BY4743pdc2Δ519 який показав стабільне зниження етанолу. Дивно, але вироблення гліцерину BY4743pdc2Δ519 не збільшували, а зменшували, демонструючи статистично значущі відмінності з контролем у кінцевій концентрації та виході глюкози для гліцерину. На відміну від BY4743pdc2Δ344 який раніше не показував, що зниження етанолу не дало більше гліцерину, ніж контроль, із статистично значущими вищими значеннями. Принаймні для Δpdc2 диплоїдних мутантів, здається, немає чіткої кореляції між виробництвом етанолу та гліцерину та зниженням етанолу, що спостерігається у BY4743pdc2Δ519 не є наслідком збільшення концентрації гліцерину.

Кінетичний аналіз виноробства за рахунок втрати ваги CO2

Криві втрати ваги накопиченого СО2 під час експериментів з виноробства 1 (a), 2 (b), 3 (c) і 4 (d) з батьківськими та мутантними штамами. Еволюцію кожної вініфікації щодня контролювали шляхом вимірювання втрати ваги СО2. Кожна точка представляє середнє значення трьох незалежних культур

Вставка pdc2Δ519 мутація комерційних EC1118 та штатів винних дріжджів Mab2C

Обговорення

Перед кількісною оцінкою ферментативних параметрів кожного лабораторного мутантного штаму ми перевірили здатність до росту pdc2Δ519 і pdc2Δ344 мутанти в аеробних умовах з глюкозою як джерелом вуглецю. Всі мутанти могли нормально рости, не маючи різниці у відповідних контролях. Це вже був позитивний результат, враховуючи неможливість повного Δpdc2 видалення, щоб рости в таких умовах (Hohmann 1993; Nevoigt and Stahl 1996). Тим не менш, досить дивно, що жоден з мутантів не виявив дефекту росту, особливо BY4741pdc2Δ519 який несе лише мутантну версію Pdc2p з делецією 519 амінокислот, що становить 56% білка дикого типу. Очевидно, що активність лише місця зв'язування є достатньою для підтримки нормального росту дріжджів.

У цьому дослідженні ми представляємо альтернативну мікробіологічну стратегію зменшення вмісту етанолу у вині шляхом генетичної модифікації S. cerevisiae Фактор транскрипції Pdc2p. Наші результати демонструють, що вставка pdc2Δ519d мутація штаму винних дріжджів може зменшити концентрацію етанолу до 1,89% об./об., не впливаючи на ефективність бродіння. На відміну від стратегій, що не ґрунтуються на ГМО, наш підхід дозволяє вставляти вибрану мутацію в будь-який місцево вибраний штам вина, що дає змогу виробляти якісні вина з регіональними характеристиками та меншим вмістом алкоголю. Це робить нашу роботу цінним внеском у проблему високої концентрації етанолу у вині. Тим не менше, пілотні випробування, доповнені сенсорним аналізом вироблених вин, необхідні для повної оцінки потенціалу нашого штаму для його застосування у виноробній галузі.