Кишкові бактеріальні спільноти в гігантській равлиці Achatina fulica та їх модифікація дієтою на основі цукрового очерету

Національний інститут метрології, Qualidade e Tecnologia, Ріо-де-Жанейро, Бразилія

Національний інститут метрології, Qualidade e Tecnologia, Ріо-де-Жанейро, Бразилія

Афіліація Інституту біохіміки Медика, Федеральний університет Ріо-де-Жанейро, Ріо-де-Жанейро, Бразилія

Національний інститут метрології, Qualidade e Tecnologia, Ріо-де-Жанейро, Бразилія

Афіліація Національного інституту контролю в Сауде, Фундасао Освальдо Крус, Ріо-де-Жанейро, Бразилія

Філіальна лабораторія Національного департаменту обчислювальної літератури, Ріо-де-Жанейро, Бразилія

Філії Інститут національної метрології, Qualidade e Tecnologia, Ріо-де-Жанейро, Бразилія, Інститут Освальдо Круз, Фундасао Освальдо Круз, Ріо-де-Жанейро, Бразилія

Філії Інститут національної метрології, Qualidade e Tecnologia, Ріо-де-Жанейро, Бразилія, Інститут біофізики Карлос Шагас Фільо, Федеральний університет Ріо-де-Жанейро, Ріо-де-Жанейро, Бразилія

Філіальний департамент Біокіміка, Університет штату Ріо-де-Жанейро, Ріо-де-Жанейро, Бразилія

Афіліації Національного інституту метрології, Qualidade e Tecnologia, Ріо-де-Жанейро, Бразилія, Інституту біохіміки Медика, Федерального університету Ріо-де-Жанейро, Ріо-де-Жанейро, Бразилія

Олександр М. Кардозу,
Janaína J. V. Cavalcante,
Рікардо П. Вієйра,
Джойс Л. Ліма,
Марія Анджела Б. rieріко,
Майса М. Клементино,
Ана Тереза Р. Васкончелос,
Елой С. Гарсія,
Вандерлі де Соуза,
Родольфо М. Альбано

Цифри

Анотація

Інвазивна сухопутна равлик Achatina fulica - один із найбільш шкідливих сільськогосподарських шкідників у всьому світі, що представляє потенційно серйозну загрозу для природних екосистем та здоров'я людини. Відомо, що цей вид переносить паразитів і приховує щільну метаболічно активну мікробну спільноту; однак про його різноманітність та склад відомо мало. Тут ми вперше оцінили складність бактеріальних спільнот, що трапляються в травних трактах полів, зібраних равликами (FC), використовуючи незалежний від культури молекулярний аналіз. Потім рослинні та кишкові бактерії у ФК порівнювали з бактеріями із груп равликів, яких вирощували в лабораторії (РЛ) на дієті на основі цукрової тростини. Більшість відновлених послідовностей були новими та пов’язаними з такими, як повідомляється про травоїдних кишках. Зміни у відносній чисельності Bacteroidetes і Firmicutes спостерігались, коли равликів годували раціоном з високим вмістом цукру, що свідчить про те, що мікробіота кишок равликів може впливати на рівняння енергетичного балансу. Крім того, це дослідження являє собою перший крок у отриманні кращого розуміння мікробіоти кишок наземних равликів і показує, що це складна система голобіонтів, що містить різноманітні, рясні та активні мікробні спільноти.

Цитування: Cardoso AM, Cavalcante JJV, Vieira RP, Lima JL, Grieco MAB, Clementino MM, et al. (2012) Бактеріальні спільноти кишок у гігантській равлиці Achatina fulica та їх модифікація дієтою на основі цукрового очерету. PLoS ONE 7 (3): e33440. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033440

Редактор: Ахмед Мустафа, Американський університет у Каїрі, Єгипет

Отримано: 23 листопада 2011 р .; Прийнято: 9 лютого 2012 р .; Опубліковано: 15 березня 2012 р

Фінансування: Цю роботу підтримали Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) та Conselho Nacional de Devolvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Гігантська африканська равлик Achatina fulica є рідною для лісових районів Східної Африки, але завдяки втручанню людини та високій інвазійній здатності її сьогодні можна зустріти в багатьох регіонах земної кулі, включаючи тропічні ліси в Бразилії. Як повідомляється, цей молюск є проміжним переносником глистів та мікроорганізмів, що спричиняє широкий спектр захворювань [1], [2]. A. fulica дуже пристосований до широкого кола середовищ, можливо, модифікуючи свою мікробіоти кишечника відповідно до місцевих умов. Тому існує припущення, що наземні види мають велику здатність до адаптації та виживання та можуть містити інтригуючу мікробіоти, яка спеціалізується на швидкому гідролізі та бродінні лігноцелюлозної рослинної біомаси з надзвичайною ефективністю [3]. Однак мікробне різноманіття в межах легеневих сухопутних равликів дотепер було лише слабо досліджено попередніми дослідженнями з використанням методів вирощування [3], [4].

Нещодавні метагеномні дослідження та дослідження на основі кремнію надали вагомі докази того, що кишкові бактерії виконують корисні функції для господаря, такі як перетравлення складних полісахаридів, вироблення енергії (перетворення цукру в коротколанцюгові жирні кислоти), синтез необхідних амінокислот і вітамінів, профілактика зростання шкідливих організмів та захист від деяких хвороб [5] - [7]. Дослідження з використанням безхребетних також припускають, що існує ще багато мікробного різноманіття, яке ще не описано, що може виявити цікаві метаболічні взаємодії. Наприклад, перший метагеномічний аналіз мікрофлори задніх кишок вищого терміта проливає світло на мікробний метаболізм та відповідні функціональні гени для біотехнологічних застосувань, таких як виробництво біопалива [8]; у таких безхребетних, які годують кров’ю, таких як лікарська п’явка, складні мікробні спільноти, ймовірно, важливі для придатності господаря через потребу в дефіцитних у крові поживних речовинах [9]; у мух цеце та комарів пов'язана з ними мікробіота може також впливати на компетентність переносника комах за допомогою декількох механізмів, таких як активація їх імунних реакцій або безпосереднє пригнічення розвитку патогенів [10].

Останні роботи показують, що планорбідні равлики містять дуже різноманітну кишкову бактеріальну спільноту [11], але на сьогоднішній день ми знаємо порівняно мало про мікробіоти, пов'язані з наземними равликами. Тут для оцінки мікробного різноманіття та сукцесії бактеріальної спільноти в шлунково-кишковому тракті інвазивної гігантської сухопутної равлики був проведений незалежний від культури молекулярний аналіз. Це дослідження являє собою перше дослідження, яке виявляє кишкові бактеріальні спільноти всередині Achatina fulica, а також порівнює вплив дієти на основі цукрового очерету на склад кишкової спільноти.

Матеріали і методи

Заява про етику

Заява про етику для цієї роботи не потрібна. Для описуваних польових досліджень не вимагалося спеціальних дозволів. Місцезнаходження не є приватною власністю або жодним чином охороняється і не включає види, що перебувають під загрозою зникнення або охорону.

Відновлення бактерій із зразків сільськогосподарських культур та калових мас

У Ріо-де-Жанейро, Бразилія, було виловлено сім польових равликів Achatina fulica масою 70–80 г. Щойно зібрані зразки калу поміщали в стерильну пробірку на льоду і негайно переносили в лабораторію і заморожували при -80 ° C до вилучення ДНК. Щоб мінімізувати появу транзиторних бактерій у рідині, равликів витримували в умовах голодування з природним фотоперіодом приблизно 72 год, без води та без субстрату перед забором зразка шляхом канюляції ротової частини стравоходу безголевим набором вен на шкірі голови прикріплений до шприца (малюнок S1). Потім тих самих тварин вирощували в лабораторії. Їх дієта складалася з високоенергетичної дієти, яка містила лише цукровий очерет протягом шести місяців. З них три грама об'єднаних зразків фекалій енергійно суспендували в 50-мл пробірці Falcon, яка містила 45 мл PBS (сольовий розчин, забуференний фосфатом; 8 мл -1 NaCl, 0,2 мл -1 KCl, 1,44 мл -1 Na2HPO4 · 12H2O, 0,24 мл -1 KH2PO4, рН 7,6). Потім фекальну суспензію та посіви рідини фільтрували через 0,2 мкм фільтри Sterivex (Millipore) після фільтрації через 3,0 мкм, щоб відокремити вільно живуть мікроби від більших організмів та частинок.

Клонування побудови та послідовності бібліотек

Біоінформаційний аналіз

Усі послідовності були вирівняні у всьому світі за допомогою програмного забезпечення MUSCLE [15] та додатково уточнені вручну. Дані про відстані генерували з бібліотеки клонів за допомогою двопараметричної моделі Kimura та аналізували за допомогою комп’ютерної програми MOTHUR [16] для групування послідовностей в оперативні таксономічні одиниці (OTU) на основі 97% відсічення ідентичності послідовності. MEGA4 [17] був використаний для побудови дерева UPGMA, яке було завантажено в ретрансляцію 1000 разів. Аналіз незважених основних координат (PCoA) проводився для оцінки подібності серед зразків за допомогою UNIFRAC [18].

Результати і обговорення

Про склад мікробіоти равликів відомо мало. У цій роботі ми дослідили, чи змінюється різноманітність та склад бактеріальних спільнот у різних частинах травного тракту гігантської сухопутної равлики Achatina fulica. Ми також порівняли відносний вплив дієти з високим вмістом вуглеводів на структуру бактеріального співтовариства кишечника. Кишечник A. fulica надзвичайно простий (рисунок 1), можливо, завдяки наземному життю та харчовим звичкам. Урожай - це найбільша частина передньої кишки, він є місцем зберігання та первинного перетравлення їжі [19]. Кишечник - це довга, вузька і звита трубка, як і у інших травоїдних тварин [20]. Щоб охарактеризувати мікробну популяцію шлунково-кишкового тракту равликів, ми відібрали вміст бактерій у посіві (C) та зразки калу (I) у семи польових равликів (FC).