Імуноферментний аналіз на сендвіч-ферменти для виявлення насіння кунжуту в продуктах харчування

1 Програма досліджень та ресурсів на харчову алергію, Департамент харчової науки та технологій, Університет Небраски, Лінкольн, NE 68588-6207, США

2 Міністерство сільського господарства та сільських справ, Дирекція контролю харчових продуктів та центральних досліджень продовольства, 16036, Бурса, Туреччина

Анотація

1. Вступ

Алергічні реакції на проковтування насіння кунжуту можуть бути спровоковані дозами до 1 мг білка насіння кунжуту для окремих випадків, а дослідження порогової чисельності показало, що приблизно 5 мг білка насіння кунжуту викликає реакцію у 10% насіння кунжуту -алергічне населення [5]. Насіння кунжуту містить декілька алергенних білків, які були ідентифіковані та частково охарактеризовані [6–9]. Кунжутне масло також може представляти небезпеку для осіб, які страждають алергією на насіння кунжуту, оскільки воно часто не є високоочищеним і, отже, містить залишки білка [10].

2. Матеріали та методи

2.1. Препарат імуногену

2.2. Виробництво поліклональних антитіл

Одну козу імунізували 1,0 мг знежиреного імуногену насіння кунжуту, емульгували CFA і вводили підшкірно (с.к.). Перша прискорена ін’єкція, що складається з 500 μг імуногену насіння кунжуту в IFA, вводили через 2 тижні після первинної імунізації. Подальші бустерні ін’єкції вводили по 250 μг знежиреного насіння кунжуту в IFA кожні 3 тижні після цього, чергуючи с.к. і внутрішньом’язово (в/м). Перший тестовий кровотеча був зроблений після другої інжекційної дози (приблизно через 5 тижнів після первинної ін'єкції), а після цього тестові кровотечі були взяті через 10 днів після кожної бустерної ін'єкції.

Три кури спочатку імунізували знежиреним імуногеном насіння кунжуту в CFA, після чого робили прискорені ін’єкції через 2 тижні з використанням 200 μg в IFA (s.c. та i.m., в якості альтернативи) в основному згідно з Schade et al. [15]. Через вісім тижнів після первинної імунізації ця група відпочивала приблизно 6 тижнів, а потім прискорювальні ін’єкції змінили на 3-тижневі інтервали через спостережуване зменшення продукції антитіл.

Розвиток титру моніторили за допомогою неконкурентного ІФА, в основному, як описано Hefle et al. [16]. Коротше кажучи, мікропланшетні пластини (MaxiSorp, Nagle Nunc International, Роскілле, Данія) були покриті 1 μг білка насіння кунжуту/мл буфера для покриття (0,015 М Na2CO3, 0,035 М NaHCO3 та 0,02% NaN3, рН 9,6) та інкубували протягом ночі при 4 ° C. Після блокування 350 μL PBS, що містить 0,1% желатину (свинячий, 300 цвітуть, Sigma Chemical Co., Сент-Луїс, Міссурі), сироватки з жовтків козячих або курячих яєць інкубували в різних розведеннях. Пластини промивали PBS, що містив 0,05% Tween 20, і зв’язаний козячий IgG та яєчний IgY виявляли та визначали кількісно, використовуючи комерційні кон’югати антиімуноглобуліну-лужної фосфатази (анти-козячий IgG [Pierce Chemical Co., Rockford, IL]; IgY [Promega Co., Madison, WI]), відповідно, дотримуючись інструкцій виробника. Кровотеча з кози з титрами понад 10 000 була об'єднана. Жовтки з титрами> 3000 були об'єднані.

2.3. Виділення антитіл

Поліклональні антитіла IgG частково очищали із сироваток шляхом осадження в 50 та 35% сульфаті амонію [16]. Частково очищений IgG короткочасно діалізували проти деіонізованої води, а потім екстенсивно діалізували проти 0,01 М сольового розчину, забуференного фосфатом (PBS) (0,002 M NaH2PO4, 0,008 M Na2HPO4, 0,85% NaCl та 0,02% NaN3, pH 7,4), як описано Hefle et ін. [16]. Ця фракція IgG була використана як покривне антитіло для розвитку ІФА. Імунні яйця збирали і зберігали при 4 ° C до необхідності. Фракцію IgY очищали за допомогою комерційної системи очищення EGGstract IgY (Promega Co., Madison, WI). Препарати імуноглобуліну Y зберігали при -20 ° C до необхідності. Ця фракція IgY була використана як антитіло для виявлення при розробці ІФА. Вміст білка у фракціях IgG (48,5 мг/мл) та IgY (7,7 мг/мл) визначали методом Лоурі [17].

2.4. Гель-електрофорез та імуноблотинг

2.5. Сендвіч ІФА

2.6. Стандартна крива для сендвіч-ІФА

Стандартні криві були побудовані з екстрактами хлібної суміші з додаванням відомих кількостей кунжуту у вигляді кунжутного борошна. Для цього 454 грами сухої хлібної суміші (Hodgson Mills, партія № 10 07 09 2) змішували з необхідною кількістю борошна з насінням кунжуту, щоб досягти 1000 ppm в остаточному рецепті. Ця кількість призведе до концентрації 0,01% або 100 ppm після додавання інших інгредієнтів (загальна вага 742 г). Ще 454 грами сухої хлібної суміші служили негативним контролем. До 454 грам сухої хлібної суміші додавали 30 грамів рослинного масла, 6 грамів свіжих дріжджів і 252 грами води, в результаті чого загальна вага становила 742 грами. Екстракти виготовляли із суміші хліба із колосом 1000 ppm та 0 ppm хліба (як описано нижче), і ці екстракти змішували в різних співвідношеннях для отримання розведень, необхідних для стандартної кривої. Стандартні криві були сформовані за допомогою графічного програмного забезпечення Prism (GraphPad Prism, Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія).

2.7. Порівняння з комерційними аналізами насіння кунжуту

Комерційно доступні набори ELISA для насіння кунжуту були отримані від Tepnel Biokits (Deeside, Великобританія) та ELISA Systems (Віндзор, Австралія). Були надані аналізи як готові до використання набори, включаючи всі реагенти, розріджувачі та стандарти, і проводились відповідно до інструкцій виробника. Аналіз Tepnel Biokits мав заявлений діапазон виявлення від 6 до 100 ppm, тест ELISA Systems від 0,5 до 5 ppm. Екстракти готували відповідно до інструкцій виробників наборів.

2.8. Зразки їжі

Всі зразки їжі були придбані у місцевих роздрібних торговців у Лінкольні, штат Небраска. Дев'яносто сім продуктів харчування або харчових інгредієнтів оцінювали на перехресну реакцію та матричні ефекти в ІФА. Усі зразки подрібнювали до однорідної консистенції за допомогою блендера Oster (Oster Professional Products, Чикаго, Іллінойс) або ступки, залежно від текстури зразків.

2.9. Їжа, що потрапила в природний спосіб: хліб, доданий борошном із насіння кунжуту

Суміш хліба з додаванням 100 ppm насіння кунжуту (у вигляді кунжутного борошна) та суміш хліба з негативним контролем готували, як описано для підготовки стандартної кривої сендвіч-ІФА. Суміш для хліба з колосками та суміш для хліба з негативним контролем змішувались у різних співвідношеннях, так що концентрації 100 ppm, 50 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 1 ppm і 0 ppm досягались у кінцевому хлібі. З цих сумішей хліб випікали за допомогою автоматичної хлібопечки (налаштування за замовчуванням). Після охолодження до кімнатної температури з хліба відбирали зразки з різних місць.

2.10. Їжа, що потрапила в природний спосіб: арахісове масло, додане тахіні

Тахіні та арахісове масло отримували з місцевого супермаркету. Стандарт із 10 000 частин на мільйон насіння кунжуту в арахісовому маслі готували шляхом змішування тахіні та арахісового масла у співвідношенні 1/100 (Вт/Вт). Суміш широко змішували за допомогою кухонного блендера. Продукт із 10000 частин на мільйон використовували для додавання арахісового масла в таких концентраціях: 100 частин на мільйон, 50 частин на мільйон, 10 частин на мільйон, 5 частин на мільйон, 1 на мільйон та 0 на мільйон. Всі зразки широко аналізували перед аналізом.

2.11. Приготування екстрактів для ІФА

Зразки насіння подрібнювали за допомогою кавомолки перед вилученням. Попередні дані вказували на те, що менш суворі методи подрібнення давали відносно низькі показники відновлення, коли були присутні цілі насіння кунжуту (не показано). Зразки ґрунту екстрагували 1:10 (мас./Об.) В 0,01 М PBS протягом 2 год при кімнатній температурі при обережному струшуванні за допомогою шейкера Labquake (Barnstead/Thermoline, Dubuque, IA). Екстракти очищали центрифугуванням при 3200 × g при 10 ° C в центрифузі Sorvall (Kendro Laboratory Products, Newtown, CT). Свіжі екстракти використовували і зберігали при 4 ° C до 5 днів.

Екстракти для випробування на перехресну реакційну здатність випробовували у нерозведеному вигляді, у 10 разів розбавляли і у 100 разів у розведеному вигляді, і результати розраховували як еквівалентність насіння кунжуту на мільйон з використанням 1 000 000 ppm реакційної здатності для насіння кунжуту.

3. Результати та обговорення

3.1. Характеристика антитіл

) вказав на важливу роль глобуліну 11S, Ses i 6 та Ses i 7, зокрема його базової субодиниці приблизно 25 кДа [9]. Хоча ми не виявили білків та алергенів, на які реагували наші поліклональні антитіла, ми бачимо хорошу реакційну здатність в області низької молекулярної маси, характерної для 2S альбумінів та олеозинів, ймовірно, що відображає реакційну здатність до Ses i 1, Ses i 2, Ses i 4, Ses i 5 та/або основна субодиниця Ses i 6 та Ses i 7. Крім того, ми бачимо чітку реакційну здатність обох поліклональних антитіл в області 45 кДа, ймовірно, відповідну Ses i 3. Оскільки насіння кунжуту використовують як їжу інгредієнт як ціле насіння, борошно або паста, виготовлена з цілого насіння, малоймовірно, що окремі алергени відокремлюються один від одного під час обробки їжі. Отже, якщо набір антитіл розпізнає кілька білків або алергенів, вони потенційно придатні для використання при розробці ІФА для виявлення залишків насіння кунжуту в ряді харчових продуктів.

3.2. Чутливість ІФА

З поліклональними антитілами, вирощеними у козла та курки, був розроблений сендвіч-ІФА із використанням козячого антитіла як оболонки та антитіла IgY до курячого яєчного яйця як детектора. Сендвіч ELISA тестували на чутливість, вимірюючи діапазон відомих концентрацій екстракту борошна насіння кунжуту, доданого в хлібну суміш. На малюнку 2 показаний типовий приклад середнього показника 9 незалежних аналізів. Чутливий діапазон - від 0,15 до 37 ppm насіння кунжуту в хлібній суміші. Найнижчий випробуваний стандарт становив 0,02 проміле; однак відгук цієї вибірки був близьким до фонового сигналу. Зразки 0,5 ppm постійно давали поглинання, які були значно вище фонового сигналу, і тому ми використовували 0,5 ppm як нижню межу кількісного визначення (LLOQ). Можна виконати інтерполяцію між 0,5 і 0,02 ppm, але обчислені результати можуть бути неточними.

Інші аналізи для виявлення залишків насіння кунжуту в харчових продуктах були описані раніше на основі імунохімічної методології або методології ампліфікації ДНК. Чутливість імунохімічних методів варіювалась від 0,6 ppm сезамового білка (сендвіч ІФА [12]) до 5 ppm сезамового білка (інгібування ELISA [11]). Чутливість методу ампліфікації ДНК в одному звіті становила 50 ppm [13] та 5 ppm в іншому звіті [14]. Принаймні один із цих методів Schöringhumer et al. [13] може не виявити клінічно значущих рівнів залишків насіння кунжуту на основі референтної дози VITAL [22]. Крім того, методи ампліфікації ДНК виявляють ДНК, а не алергенну білкову частину насіння кунжуту. Тому результати, отримані за допомогою методів ампліфікації ДНК, слід інтерпретувати з більшою обережністю, особливо для оброблених харчових продуктів, що містять інгредієнти на основі кунжутного насіння, де алергенна частина білка відокремлена від фракції ДНК/РНК.

3.3. Специфічність ІФА

3.4. Порівняння різних імуноаналізів насіння кунжуту: відновлення з різних матриць

Умови харчової обробки, зокрема термічна обробка, як випічка, часто призводять до зменшення відновлення алергенів при аналізі за допомогою імуноаналізів. Крім того, харчові продукти, що містять високий вміст жиру, є складними матрицями для виявлення залишків алергену [28]. Для насіння кунжуту було визначено, що відновлення цільнозернового хліба було нижчим, ніж очікувалось [11]. Ми порівняли наш розроблений на сьогодні аналіз з двома комерційно доступними аналізами для виявлення залишків насіння кунжуту щодо відновлення з важких харчових матриць. Були приготовані два зразкові харчові продукти: хліб, випечений із борошна, доданого до борошна з кунжутом, та арахісове масло, додане тахіні. Для комерційних аналізів застосовували процедуру екстракції, рекомендовану виробником набору.

Наш ІФА насіння кунжуту також порівнювали з двома комерційними наборами ІФА після додавання арахісового масла з відомими кількостями тахіні (Таблиця 3). Як пояснюється для таблиці 2, розбавлені стандарти знову використовувались для отримання інформації про відновлення залишків насіння кунжуту в харчових продуктах, доданих низьким рівнем кунжутної пасти. Знову ж таки, це не справжнє кількісне визначення, але дані наведені в Таблиці 3 для інформаційних цілей. Для модельного харчового продукту з тахіні поточний аналіз показав найкраще відновлення (середнє значення: 83%), тоді як аналіз Тепнела-Неогена призвів до завищення вмісту кунжуту (середнє відновлення: 239%). Аналіз від ELISA Systems мав середнє відновлення 6% і не міг виявити найнижчу концентрацію колосків 1 ppm насіннєвої пасти.

Виділення харчових алергенів з харчових продуктів для виявлення та кількісного визначення є предметом дослідження вже давно. Більшість опублікованих робіт присвячена виявленню арахісу. Відновлення від шоколадних виробів та печива було перевірено на різні (комерційно доступні) тести в кільцевих випробуваннях. Одне конкретне дослідження, яке включало 5 різних аналізів на залишки арахісу та 30 європейських лабораторій, виявило, що видобуток становить від 44 до 191% для стрибків з низьким вмістом на мільйон [29]. Для аналізів насіння кунжуту таких комплексних випробувань на кільцях не існує. З двох повідомлених імуноаналізів для виявлення залишків насіння кунжуту вилучення становили від 70 до 160% [11] та від 42 до 145% [12]. У цих дослідженнях не використовувались інші аналізи, а випробовувались лише хлібобулочні вироби, обмежуючи загальну придатність їх даних для більш широкого асортименту харчових продуктів.

4. Підсумкові зауваження

Розроблено набір поліклональних антитіл для виявлення білка насіння кунжуту. Сендвіч ELISA, сконструйований з цими антитілами, був чутливим і специфічним для виявлення залишків насіння кунжуту. Однак відновлення від випечених харчових продуктів було низьким. Інші аналізи, мабуть, мають кращі результати для деяких харчових продуктів. Сучасні дані показують, що для надійного вимірювання залишків насіння кунжуту в різних харчових продуктах можуть знадобитися різні аналізи, і що слід бути дуже обережним при оцінці рівня залишків насіння кунжуту в харчових продуктах.

Конфлікт інтересів

Автори заявляють, що не існує конфлікту інтересів щодо публікації цієї статті.

Подяка

Автори бажають визнати провідну роль покійного професора Сьюзен Хефле у цьому дослідницькому проекті. Професор Гефле ініціював цей дослідницький проект і керував розробкою експериментальних підходів.