Ідентифікація членів білка теплового шоку кавуна та аналіз експресії специфічного для тканини гена при комбінованих стресових та посухових стресах

Ясемін Челік АЛТУНОЙЛУ

1 Кафедра генетики та біоінженерії, Факультет техніки та архітектури, Університет Кастамону, Кастамону, Туреччина,

Мерве КЕЛЕŞ

Тевфік Хасан МОЖЕ

Мехмет Ченгіз БАЛОУЛУ

Анотація

1. Вступ

Citrillus lanatus (кавун) - важлива рослина з сімейства Cucurbitaceae, що становить 7% загальних полів у світі, присвячених рослинництву. Світове щорічне виробництво кавуна (Citrillus lanatus) становить близько 90 мільйонів тонн, а кавун (Citrillus lanatus) входить до 5-ти найбільш споживаних свіжих фруктів (FAO, u1d42). Хоча кавун (Citrillus lanatus) в основному складається з води (до 90%), він містить важливі поживні сполуки, такі як цукор, лікопін та амінокислоти, що зміцнюють здоров’я, включаючи цитрулін, аргінін та глутатіон (Hayashi et al., 2005; Perkins-Veazie et al., 2006; Collins et al., 2007; Guo et al., 2013).

Білки теплового шоку (Hsps) - це особливе сімейство білків, які синтезуються у відповідь на різноманітні стресові умови, включаючи високі температури, і необхідні для росту та виживання клітини (Whitley et al., 1999; Kumar et al., 2012; likelik Altunoğlu, 2016). Hsps функціонують у багатьох процесах, таких як згортання білка, клітинна регуляція та інгібування накопичення невідповідних білків у клітині. Крім того, відомо, що члени цього сімейства білків синтезуються в різних стресових умовах і поводяться як молекулярні шаперони, які дозволяють білкам перетворюватися в тривимірну структуру шляхом згортання (Henle et al., 1998). Вони також є ключовими детермінантами контролю якості та відіграють важливу роль у захисті загального клітинного білкового балансу (Kumar et al., 2012).

Повні геномні дані організмів корисні для визначення важливих сімей генів за допомогою біоінформатичних методів. Hsps характеризуються для багатьох видів рослин, включаючи арабідопсис (Swindell et al., 2007), пшеницю (Muthusamy et al., 2017), соняшник (Büyük et al., 2012), рис (Singh et al., 2010; Jiang та ін., 2014; Wang та ін., 2014), томат (Zai та ін., 2017), тополя (Yer та ін., 2016; Yer та ін., 2018) та евкаліпт (Altunoğlu, 2016). Повну послідовність геному кавуна опублікували Guo et al. у 2013 році; однак, наскільки нам відомо, члени сім'ї Hsp ще не визначені в геномі кавуна. У поточному дослідженні виявлено та охарактеризовано гени Hsp кавуна. Крім того, експериментально аналізували профілі експресії генів в комбінованих умовах посухи та теплового стресу, а результати порівнювали за допомогою біоінформатики.

2. Матеріали та методи

2.1. Ідентифікація генів білка теплового шоку (hsp) в геномі кавуна

Згідно з нашим раніше опублікованим дослідженням (Baloğlu, 2014b; Baloğlu, 2014c; Kavas et al., 2015; Kavas et al., 2016), для висвітлення генів Hsp з генома кавуна проводились різні стратегії пошуку. По-перше, за допомогою бази даних HSPIR (Heat Shock Protein Information Resource) було отримано геномну, кодуючу область та білкові послідовності генів Hsp для всіх рослин. Для цих послідовностей був проведений пошук BLASTP (Порівняння послідовності білкової бласт-системи) за допомогою бази даних Cucurbit Genomics. Крім того, визначені послідовності були відскановані та відібрані відповідно до захищених регіонів за допомогою моделі прихованого Маркова (HMM). Захищені ділянки вибраних послідовностей перевіряли за допомогою бази даних Pfam (https://pfam.xfam.org/) і отримували для дослідження як кавунові Hsps. Індекс нестабільності, молекулярні ваги та значення ізоелектронного ефекту (pI) цих послідовностей Hsp були отримані за допомогою інструменту ProtParam (u1d45).

2.2. Визначення хромосомних локалізацій та оцінка генної структури hsps

Хромосомні локалізації генів Hsp, знайдені в рослинах кавунів, проводились за допомогою бази даних Cucurbit Genomics (u1d46); ці локалізації потім показували на хромосомах за допомогою програми MapChart. Для уточнення структури генів Hsp кавуна визначали екзон-інтронні ділянки генів за допомогою сервера відображення структури генів (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) (Hu et al., 2015 ).

2.3. Вирівнювання послідовності, філогенетичний аналіз та ідентифікація збережених мотивів

Багаторівневе вирівнювання послідовностей визначеного кавунового Hsps проводили за допомогою ClustalW за допомогою програми MEGA7. Філогенетичні дерева малювали за допомогою послідовностей, вирівняних за програмою ClustalW. Метод максимальної правдоподібності (Milligan, 2003) був використаний при малюванні філогенетичного дерева. За допомогою цього методу було сформовано філогенетичне дерево з 1000 повторюваними аналізами початкового завантаження. Намальоване філогенетичне дерево було візуалізовано за допомогою бази даних iTOL, і кожен кластер був позначений іншим кольором. Для ідентифікації збережених мотивів був використаний веб-портал MEME Suit (Bailey et al., 2015). Коли було визначено, кількість мотивів становило 20, а ширина мотиву була обрана оптимальною ≥2 та ≤300. Отримані мотиви також сканувались за допомогою бази даних InterPro з InterProScan (Quevillon et al., 2005).

2.4. Аналіз генної онтології

Програма Blast2Go була використана для функціонального аналізу детермінованих кавунів Hsps (Conesa та Götz, 2008). Амінокислотні послідовності кавуна Hsps завантажували, а біологічні та молекулярні функції та клітинний вміст отримували класифікацією GO, дотримуючись таких етапів, як BLAST, interpro, картографування, анотація, складання графіків та графіків.

2.5. Обчислення гомологічних та негомологічних ставок змін

Багаторазове вирівнювання амінокислотних послідовностей проводили за допомогою програми ClustalW, вирівнюючи ортологічні пари генів серед продубльованих генів Hsp у геномі кавуна та Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Glycine max, Populus trichocarpa, Vitis vinifera та Zea mays. Потім обчислювали гомологічний (Ks) та негомологічний (Ka) обмінні курси, використовуючи програму PAL2NAL методом, який вирівнює амінокислотні послідовності генів Hsp з їх вихідними комплементарними послідовностями ДНК (Suyama et al., 2006). Таким чином, для кожного гена Hsp розраховувались дублікації та час поділу (мільйон років тому, MYA), використовуючи коефіцієнти гомологічних мутацій змін λ, що відповідають кожній гомологічній області та року (T = Ks/2λ (λ = 6,5 × 10−9) ( Лінч та Конери, 2000; Ян та ін., 2008).

2.6. Гомологічне моделювання Hsps

Було проведено сканування Банку даних білків (PDB) для виявлення послідовностей, подібних до білків Hsp кавуна та найбільш підходящого зразка з відомою тривимірною структурою, використовуючи BLASTP (Berman et al., 2000). Можливі тривимірні структури кавуна Hsps аналізували за допомогою програми Phyre2 з отриманими даними (Kelley et al., 2015).

2.7. Ідентифікація міРНК, націлених на гени hsp у кавуні

База даних рослинних miRNA була використана для ідентифікації miRNAs, націлених на раніше відомі рослинні гени miRNA, використовуючи програму miRBase v20.0 (http://www.mirbase.org/) для ідентифікації контрольованих miRNA цільових генів (Budak and Akpinar, 2015) . Усі передбачувані рослинні та кавунові мікроРНК були ідентифіковані шляхом вирівнювання всіх відомих рослинних мікроРНК із транскриптами гена Hsp у рослині кавуна за допомогою сервера цільової psRNA (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/home) (Dai and Zhao, 2011).

2.8. Визначення профілів експресії генів hsp кавуна за допомогою транскриптомних даних

Для аналізу RNA-Seq усі показники Illimuna HiSeq були надані через відкритий архів баз даних під назвою SRA (Sequence Read Archive). Номери приєднання: SRR1724899, SRR1724900, SRR1724901, SRR1724902, SRR1724903, SRR1724943 (плоди плодів 10-го, 18-го, 26-го, 34-го, 42-го та 50-го днів, зібрані після запилення відповідно), WM-UR-1/SRR1001435, WM-UR-2/SRR1001436 (білі плоди через 10 днів після запилення), WM-IM-1/SRR1001437, WM-IM-2/SRR1001438 (біло-рожеві плоди через 18 днів після запилення), WM-PM-1/SRR1001439, WM-PM-2/SRR1001440 (рожеві плоди через 28 днів після запилення), WM-MA-1/SRR1001441, WM-MA-2/SRR1001442 (стиглі червоні плоди через 34 дні після запилення), SRR494474, SRR518988, SRR518988 (флоемна тканина), SRR494479, SRR518992, SRR518993 (судинні тканини). Дані необробленої послідовності «.sra» всіх показань були завантажені та перетворені у формат «fastq» за допомогою команди fastq-dump NCBI SRA Toolkit. Аналіз FastQC був проведений для того, щоб здійснити контроль якості всіх інших показників, щоб видалити низькоякісні з отриманих показань. Нормалізація та перетворення всіх показань проводились за допомогою програми CLC Genomic Workbench версії 11.1. Ієрархічна карта кластеризації (HeatMap) була складена за допомогою вимірювань експресії генів за допомогою програми Permut Matrix.