Гіпотрофія матері впливає на морфологію плаценти та транспорт. Походження для поганого росту нащадків та вразливості до хвороб

Анотація

Вступ

Плацента є активним учасником вагітності, виконуючи функції провідника між матір'ю та плодом. У цій якості він може сприяти зростанню плода за допомогою передачі поживних речовин та кисню 1–3 та мінімізувати несприятливий вплив від потрапляння до плоду через викидні транспортери та інші бар’єрні системи 4. Коли його функція оптимальна, плацента може адаптуватися до змін у середовищі вагітності та захищати плід від несприятливого впливу 1,5. Але якщо здатність плаценти реагувати на подразники навколишнього середовища порушена, можливо, через змінений розвиток та/або функцію плаценти, адаптація може бути недостатньою або відсутнім, а ріст та розвиток плода можуть негативно позначитися на 1,5. Поганий ріст плода є проблематичним: він пов'язаний з неоптимальними траєкторіями росту в ранньому віці та підвищеним ризиком хронічних захворювань у довгостроковій перспективі 6,7. Проте залишається незрозумілим, як плацента адаптується до змінених умов вагітності таким чином, що може сформувати ріст плода і, можливо, лежить в основі раннього походження пізнішої хвороби.

матері

Не всі плоди, що перебувають у несприятливих умовах внутрішньоутробного розвитку, мають ознаки порушеного росту, що може пояснюватися адаптаційною здатністю плаценти, що впливає на її здатність діяти як селективний бар’єр для трофічних факторів та інших ксенобіотиків. Ми висунули гіпотезу про те, що плацента може по-різному адаптуватися до материнської дієти ООН та СН через зміни у її розвитку та функціях, і ці адаптації пояснюватимуть, чому потомство матерів ООН та СН високо зростає внутрішньоутробно, та могли виявити механізми, що лежать в основі розвитку пізніших захворювань . Щоб вирішити цю проблему, ми оцінили вибрані маркери розвитку плаценти, а також АВС і транспортери жирних кислот в кінці вагітності у дам, які харчувались нормальним раціоном ООН або годували високочастотною дієтою, та визначали вплив цих дієт на материнський метаболізм та ріст плоду.

Методи

Тварина модель

Збір та обробка біозразків

На GD18.5, період пікового росту плода і лише після досягнення пікового об'єму плаценти, материнського простору крові та розвитку капілярів плода 51, дамби були вбиті дислокацією шийки матки. Відразу після цього вимірювали глюкозу в хвості за допомогою комерційного глюкометра (Roche Accucheck). Дамби обезголовили, а кров стовбура збирали в пробірки, покриті гепарином, для виділення плазми. Плоди та плаценти швидко видаляли з матки та зважували, а тканини миттєво заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° С для подальших молекулярних аналізів, або промивали крижаним 1X PBS, потім фіксували у 10% нейтралізованому формаліном, з подальшим зберіганням у 70% EtOH при 4 ° C перед введенням у парафін для подальших гістологічних аналізів.

Гістологічні аналізи

Плацентарні зрізи, вбудовані у парафін на 5 мкм, фарбували відповідно до стандартних протоколів гематоксиліном та еозином Y (H&E), періодичною кислотою – Шиффом (PAS) або специфічними первинними та вторинними антитілами, як описано нижче. Слайди, зафарбовані H&E та PAS, були скановані цифровим способом із збільшенням у 5 або 20 разів відповідно за допомогою цифрового сканера слайдів Hamamatsu у Центрі оптичного зображення Луненфельда-Таненбаума. Отримані зображення переглядалися за допомогою плагінів ImageJ та ImageJ NDPITools 52. Міри плацентарних ділянок стику та зони лабіринту розраховували, як описано Bloise et al. 53 (2012). PAS-позитивні клітини підраховували у всьому плацентарному відділі і виражали як кількість PAS-позитивних клітин/область спонгіотрофобласту або/зона JZ. Підрахунок площі плаценти та аналіз зображення проводили на одній чоловічій та одній жіночій плацентах з кожної дієтичної групи, де кожна вибрана проба представляла середню масу плода та плаценти для цієї дієтичної групи 53,54. Один спостерігач, засліплений експериментальними групами, проводив аналіз зображення.

Плаценти фарбували для P-gp (1: 500, D-11 Санта-Крус, Міссісога, Канада) та BCRP (1: 200, Кальбіохем, Етобікок, Онтаріо, Канада), як описано вище із наступними змінами: зрізи гасили за допомогою 0,03 % перекису водню в 1X PBS протягом 30 хвилин при кімнатній температурі; вторинним антитілом було біотинільоване антитіло миші козла (1: 200, Vector Labs); і час інкубації субстрату пероксидази DAB для візуалізації сигналів антитіл становив 30 секунд як для P-gp, так і для BCRP. З забруднених зрізів було випадковим чином зафіксовано шість зображень зі збільшенням у 20 разів (інвертований мікроскоп Leica DMIL LED та програмне забезпечення QCapture Pro) у спонгіотрофобласті та в зонах лабіринту. Напівкількісний аналіз для оцінки інтенсивності фарбування на кожному зображенні проводився одним спостерігачем, засліпленим для експериментальних груп, як описано раніше 55. Фарбування було оцінено як відсутні (0), слабке (1), помірне (2), сильне (3) та дуже сильне (4). Розраховували середню інтенсивність фарбування на шести зображеннях для кожної плацентарної зони для кожної плаценти.

гібридизація in situ

Архітектуру плаценти в GD18.5 аналізували за допомогою програмної програми Visiopharm NewCAST (Горсхолм, Данія) після гібридизації in situ з використанням таких зондів: Ctsq, Prl3b1, Pcdh12 і Tpbpa, як описано раніше 19. 20% площі на плацентарний зріз було випадково підраховано при 20-кратному збільшенні (за допомогою мікроскопа Olympus BX61) з 20 точками на поле зору, що становить 8,9 мм 2 на точку/відлік. Всього було проаналізовано 3 або 4 зрізи на плаценту з 4 жіночих та 4 чоловічих плацент на дієтичну групу. Загальну або відносну площу для конкретних структур розраховували для кожного зрізу та усереднювали для плаценти. Структури, що представляють інтерес, включали клітини глікогену, PAS-позитивні клітини, синусоїдальні TGC, TGC, інтерстиціальні клітини глікогену, простір крові матері, простір крові плода, простір крові матері в JZ, лабіринтний трофобласт та область спонгіотрофобластів. Розмір JZ розраховували шляхом підсумовування областей спонгіотрофобласту, TGC та синусів JZ. Розмір LZ розраховували шляхом підсумовування площі крові плода, лабіринтного синуса та ділянок трофобласта лабіринту.

Вимірювання біомаркерів плазми

Для вимірювання біомаркерів у материнському кровообігу згідно з інструкціями виробника використовувались комерційно доступні аналізи на мишах. Плазмовий інсулін (ультрачутливий мишачий ІФА, ALPCO, Салем, NH, США), лептин (мишачий ІФА, Crystal Chem, Downers Grove, Іллінойс, США), адипонектин (ІФА мишачої високої молекулярної маси, ALPCO, Салем, NH, США) та тригліцериди (LabAssay Triglyceride Kit, Wako, Richmond, VA, USA) вимірювали у плазмі. Вільні жирні кислоти (Набір для вимірювання кількості вільних жирних кислот, Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) вимірювали в материнських еритроцитах, об’єднаних для кожної дієтичної групи, через малий обсяг еритроцитів, доступних від кожної тварини, що унеможливлює індивідуальні заходи тварин.

Виділення та експресія мРНК у плаценті

Загальну РНК екстрагували з плаценти 29, використовуючи реагент TRIZOL (Invitrogen), дотримуючись інструкцій виробника. Чистоту та концентрацію РНК оцінювали за допомогою спектрофотометричного аналізу (Nanodrop), а цілісність РНК перевіряли за допомогою гель-електрофорезу. 1 мкг РНК транскрибували зворотним шляхом із використанням 5X iScript Supermix зворотної транскрипції (BioRad, Міссісога, Онтаріо, Канада). Зразок з нереверсною транскрипцією (NRT; відсутність ферменту) транскрибували зворотним шляхом, щоб забезпечити негативний контроль реакції RT у додатках ПЛР нижче.

Виділення та експресія білка в плаценті

Загальний білок екстрагували з плаценти за допомогою буфера RIPA з інгібітором протеази cOmplete ™ (Sigma, Oakville, ON, Канада) та 100 мМ ортованадата натрію. Концентрацію білка визначали за допомогою аналізу BCA (Pierce, Thermo Fisher, Mississauga, ON, Canada).

Для рівнів білка LPL в плаценті застосовували специфічний для мишей ІФА (Cusabio, Houston, TX, USA) відповідно до інструкцій виробника. Всі зразки білка нормалізували до однакової концентрації в розчиннику для зразків перед аналізом. Зразки проводили у двох примірниках, середнє значення (SD)% CV між дублікатами становило 6,98 ± 4,58%.

Вимірювання плацентарних цитокінів

Білок, виділений з плацентарних гомогенатів, аналізували на вміст цитокінів згідно з інструкціями виробника, використовуючи тест Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-Plex (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) та систему Luminex (Bio-Rad; програмне забезпечення v6.0 ). Всі зразки білка нормалізували до однакової концентрації в розчиннику для зразків перед аналізом. Концентрації цитокінів виражаються як пг/мг білка. Цитокіни зі значеннями вище або нижче стандартного діапазону кривих були виключені з аналізів, залишаючи 16 цитокінів для аналізу в зразках плаценти. Крім того, плацента у жіночих плодів виявляла рівні IL-17a та G-CSF нижче нижньої межі виявлення аналізу, і тому дані, представлені для цих цитокінів, відображають значення лише у плацентах чоловічої статі. Зразки проводили у двох примірниках і середній% CV (діапазон) між дублікатами для всіх 16 цитокінів становив 5,7 (3,74-9,65).

Статистика

Вимірювальні результати були перевірені на нормальність та неоднакові дисперсії (тест Левена). Дані, які були ненормальними, трансформувались для досягнення нормальності, де це було можливо. Відмінності між дієтичними групами для вимірювання результату визначали ANOVA з пост-хоком Тукі, або Welch ANOVA з пост-спеціальним Games-Howell, або тест Крускала-Уолліса зі Steel-Dwass для непараметричних даних (p Переглянути цю таблицю:

  • Переглянути вбудований
  • Переглянути спливаюче вікно
  • Завантажте PowerPoint

Існував загальний вплив материнської дієти на збільшення ваги протягом вагітності (р = 0,002). ВЧ-матері були важчими за ООН протягом усієї вагітності (p Переглянути цю таблицю:

  • Переглянути вбудований
  • Переглянути спливаюче вікно
  • Завантажте PowerPoint

Погана материнська дієта впливає на ріст фетоплаценти і пов’язана зі зміною плацентарної архітектури

Дієта матері не змінила розмір посліду або кількість резорбцій плода при GD18,5 (табл. 2). Однак вага плода, вага плаценти та вага плода до ваги плаценти були значно нижчими в ООН у порівнянні з вагітністю як CON, так і СН (p Переглянути цю таблицю:

  • Переглянути вбудований
  • Переглянути спливаюче вікно
  • Завантажте PowerPoint

Як місця стику, так і лабіринт плаценти ООН та ВЧ були меншими порівняно з контролем; різниці були більше 10%, де плаценти ООН значно зменшили площу JZ порівняно з CON (p = 0,03; рис. 2). Поглиблений аналіз плацентарної архітектури виявив значно менший розрахований розмір лабіринту у ВЧ плацентах порівняно з CON (p = 0,03, малюнок 3). Не було впливу материнської дієти на розмір JZ плаценти або розмір JZ: співвідношення розміру лабіринту. Крім того, аналіз плацентарної архітектури виявив суттєво зменшену площу плоду крові плоду у ВЧ плацентах порівняно з плацентами CON та ООН (p = 0,003, таблиця 3 та рисунок 3). Стратифікований аналіз плацентарної архітектури продемонстрував схожі тенденції як в плацентах чоловіків, так і у жінок, але результати були значущими лише у чоловіків (p = 0,001, таблиця 3). Простір крові плода: співвідношення маси плода значно зменшилось у ВЧ плодів порівняно з КОН та ООН (p Переглянути цю таблицю:

  • Переглянути вбудований
  • Переглянути спливаюче вікно

A. Репрезентативні зображення пофарбованих H&E плацент при 5-кратному збільшенні. B. Площа лабіринтових та стикових зон (верхня панель) та відсоток зміни площі від контрольних значень (нижня панель). Дані представляють квантовий графік із діамантами довіри 95% ДІ.

Показані поперечні зрізи, пофарбовані PAS, для виявлення вмісту глікогену (червоний) у клітинах глікогену трофобластів, забарвлених гематоксиліном (синій). Врізки демонструють більш високе збільшення лабіринтних структур. Хоча менші за розміром і вагою, плаценти ООН (C, D) мають схожу морфологію порівняно з плацентами CON (A, B). ВЧ дієтичні плаценти (E, F) демонструють більш щільні лабіринтні структури зі зменшеною площею плодів крові плода. L, лабіринт; SpT, спонгіотрофобласт; ГХ, клітина глікогену; S, материнська синусоїда; D, decidua; стрілки, гігантські клітини синусоїдальних трофобластів; головки стріл, простір крові плода; зірочка; материнський лабіринтний простір крові.

А. Співвідношення у всіх плодів. B. Співвідношення у жінок. C. Співвідношення у чоловіків. Дані представляють квантильний графік із діамантами довіри 95% ДІ. p in situ гібридизація плаценти GD18,5 від чоловічих (M) та жіночих (F) однокласників контрольних (CON), недоїджених (UN) та дієт з високим вмістом жиру (HF). Показані поперечні зрізи, зондовані Ctsq та Prl3b1 для виявлення гігантських клітин, Pcdh12 для виявлення клітин глікогену та Tpbpa для виявлення спонгіотрофобласта. Хоча менші за розмірами та вагою, плаценти ООН (C, D у всіх панелях) мають схожу морфологію порівняно з плацентами CON (A, B у всіх панелях) та HF плацентами (E, F у всіх панелях). L, лабіринт; SpT, спонгіотрофобласт; стрілки, позитивний сигнал зонда.

Показані поперечні зрізи, зондовані Ctsq та Prl3b1 для виявлення гігантських клітин, Pcdh12 для виявлення клітин глікогену та Tpbpa для виявлення спонгіотрофобласта. Хоча менші за розмірами та вагою, плаценти ООН (C, D у всіх панелях) мають схожу морфологію порівняно з плацентами CON (A, B у всіх панелях) та HF плацентами (E, F у всіх панелях). L, лабіринт; SpT, спонгіотрофобласт; стрілки, позитивний сигнал зонда.

Експресія мРНК Ctsq була нижчою (p = 0,009), а експресія мРНК Pcdh12 (p = 0,0003) та Cx31,1 (p = 0,002) була вище у плацентах ООН порівняно з HF. Дані представляють квантильні ділянки з 95% довірчими діамантами CI. p Напівкількісний аналіз інтенсивності фарбування імунореактивних P-gp та BCRP у зонах спонгіотрофобластів та лабіринтів у плацентах CON, ООН та HF при GD18,5 (репрезентативні зображення див. на малюнку 6B). Дані представляють квантильні ділянки коробки з діамантами довіри 95% ДІ.

(див. малюнок 6B для репрезентативних зображень). Дані представляють квантильні ділянки коробки з діамантами довіри 95% ДІ.

Оскільки наше дослідження має поперечний переріз, ми не можемо визначити момент, протягом якого на фетоплацентарний ріст (а також структуру та функцію плаценти) почали впливати ці харчові впливи, а також на те, чи траєкторія розвитку та функції плаценти розходились у вагітності ООН та СН серед вагітності одночасно під час гестації. Ранні фенотипи плаценти важливі для характеристики, оскільки на те, як плацента реагує на вторинні виклики в подальшому періоді вагітності, без сумніву, впливатиме те, як і швидкість, з якою вона адаптується до ранніх впливів вагітності, і це особливо актуально, коли говорять про її транспорт та селективні бар'єрні функції 41. У майбутніх дослідженнях слід вивчити вплив дієт ООН та СН на плацентарну поздовжньо і пов’язати зміни в її розвитку, структурі та функції з детальними поздовжніми оцінками росту плода, складу тіла та рівня ліпідів та запалення, коли це можливо.

На закінчення ми використали інноваційний підхід для характеристики та розуміння адаптації плаценти у мишей до двох типових харчових негараздів - недоїдання та дієти з високим вмістом жиру та калорій, намагаючись пояснити, чому плоди ростуть по-різному залежно від середовища, якому вони піддаються. матка. Наше дослідження заповнює важливі прогалини в знаннях, оцінюючи плацентарну архітектуру, розвиток та функції, а також спектр гіпотрофії, що може впливати на розвиток фетоплацентарного відділу незалежно від складу материнського тіла. Крім того, наша оцінка як транспортування поживних речовин, так і ксенобіотиків є критично важливою для розуміння багатьох вагітностей у всьому світі, в яких існує багато неприємностей, включаючи неправильне харчування, інфекційні захворювання та запалення та використання ліків або наркотиків. Виявивши взаємозв'язок між несприятливими харчовими впливами та розвитком та функцією плаценти, ми можемо краще зрозуміти, чому деякі плоди ризикують або захищені від порушеного розвитку. Це може спричинити індивідуальні підходи до харчування для жінок до та під час вагітності для оптимізації розвитку плода, а в довгостроковій перспективі - постнатального росту та здоров'я протягом усього життя.

Внески автора та примітки

Внески: Концептуалізація, KLC, SJL, EB; методологія KLC, MK, EB; розслідування, KLC, EM, MK, EB, TTNN; курація даних, формальний аналіз, KLC, EB; написання - підготовка оригінального проекту, KLC; написання - огляд, KLC, EB, MK, SJL, SGM, TTNN, EM. Це дослідження фінансувалося Канадськими інститутами досліджень охорони здоров’я (CIHR) (гранти MOP-81238 та FDN-143262 SJL, стипендія MFE-246638 KLC та грант 452740 SGM). KLC підтримується Радою з природничих та технічних досліджень Канади, Фондом перинатальних досліджень Моллі Тоуелл (Новий дослідник), Управлінням з досліджень університету Карлтон та CIHR. Фінансування EB фінансується Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; 422410/2016-0).

Автори не мають конкуруючих інтересів і нічого розкривати. Ця стаття містить додаткові малюнки та таблиці.

Подяка

Ми дякуємо Річарду Маганзі за допомогу у роботі з тваринами та Рікардо Енрікесу, Лондонський університетський коледж, за те, що він поділився своїм шаблоном bioRxiv, який ми трохи змінили для використання тут.