Ген людського резистину, ожиріння та діабет 2 типу

Мутаційний аналіз та дослідження популяції

  1. Федеріка Сентинеллі 1,
  2. Стефано Ромео 1,
  3. Марчелло Арка 2,
  4. Емануела Філіппі 1,
  5. Фріда Леонетті 1,
  6. Мікела Банчієрі 1,
  7. Умберто Ді Маріо 1 і
  8. Марко Джорджо Бароні 1

  1. 1 Відділ клінічних наук, відділ ендокринології, Римський університет "La Sapienza", Рим, Італія
  2. 2 Інститут Terapia Medica Sistematica, Римський університет “La Sapienza”, Рим, Італія

Ця стаття має виправлення. Дивіться:

Мутаційний аналіз та дослідження популяції

Анотація

Поширені розлади, такі як діабет 2 типу, гіпертонія та передчасний атеросклероз, визнають стійкість до інсуліну основним патогенним фактором. Гіперинсулінемія та непереносимість глюкози часто спостерігаються при ожирінні, і знову ж бракована дія інсуліну вважається основним фактором. Сімейна передача та зміни етнічного розподілу свідчать про те, що резистентність до інсуліну є генетично детермінованою. Однак, незважаючи на вагомі докази на користь генетичного компонента, дефекти, відповідальні за резистентність до інсуліну, ще не визначені.

типу

Зовсім недавно нещодавно відкритий гормон резистин запропонував пов'язати ожиріння з діабетом (1). На моделях тварин резистин виділяється спеціально адипоцитами і помітно підвищується як при генетичному, так і при ожирінні, спричиненому ожирінням. Підвищена секреція резистину корелювала з порушенням толерантності до глюкози та дією інсуліну у мишей, тоді як лікування тіазолідиндіоном значно знижувало експресію гена резистину, а нейтралізація білка резистину посилювала засвоєння глюкози в крові та чутливість до інсуліну. Було висловлено припущення, що резистин протидіє інсуліну, модулюючи один або кілька етапів на шляху передачі сигналу про інсулін і, можливо, відіграючи певну роль у патогенезі резистентності до інсуліну. Таким чином, ген резистину є потенційним кандидатом на етіологію інсулінорезистентності та діабету 2 типу, хоча, як повідомляється, експресія гена резистину в жирових клітинах та жировій тканині у осіб із надмірною вагою майже відсутня (2), що викликає питання про роль резистину в ожирінні та цукровому діабеті у людей суперечлива.

Щоб встановити, чи можуть генетичні варіації гена резистину сприяти резистентності до інсуліну, послідовність кодування трьох екзонів гена резистину, разом з його 5 ′ регуляторною областю та 3′-UTR, була проаналізована за допомогою SSCP (3), тип 2 хворих на цукровий діабет та осіб із ожирінням.

Загалом 177 суб'єктів пройшли скринінг на наявність варіантів послідовностей у гені резистину. У групу входило 58 пацієнтів з діабетом 2 типу, 59 осіб із ожирінням та 60 нормальних суб'єктів контролю. Послідовність кДНК гена резистину (AF323081) була суміщена з BLAST 2 до чернетки послідовності клону хромосоми 19 людини CTD-3214H19 (AC008763) з метою визначення меж інтрону/екзону. Ген людського резистину кодується в сегменті 1,3 кб на хромосомі 19 (1), а 476-нуклеотидна транскрипція міститься протягом трьох екзонів. Три пари праймерів використовували для ампліфікації трьох екзонів, 5 ′ регуляторної області та 3′-UTR (таблиця 1). У екзоні 3 гена резистину був виявлений лише один варіант послідовності. Цей варіант був виявлений у 2 з 58 пацієнтів з діабетом (2 гомозиготних) та у 4 з 59 осіб із ожирінням (2 гомозиготних та 2 гетерозиготних); він не був виявлений у жодного з контрольних суб'єктів. Секвенування варіанту виявило наявність заміщення SNP в 3′-UTR екзона 3 (G1326C), 60 bp 3 ′ від стоп-кодону і 8 bp 5 ′ від сигналу поліаденіляції AATAAA.

Було показано, що SNP в 3′-UTR генів можуть впливати на експресію гена (4,5), і не виключено, що цей варіант G1326C у 3′-UTR гена резистину може впливати на експресію гена резистину. Тому ми вивчили частоту цього СНП у пацієнтів із ожирінням, діабетом та нормальними пацієнтами.

Загалом 591 суб'єкт (198 осіб із ожирінням, 207 хворих на цукровий діабет та 186 контрольних суб'єктів) вивчався на наявність варіанта G1326C гена резистину шляхом ПЛР-ампліфікації та перетравлення ферментів рестрикційного BseRI.

Клінічні характеристики суб'єктів дослідження наведені в таблиці 2. Суб'єкти, що страждають ожирінням, були значно молодшими, ніж пацієнти з діабетом та контролі. ІМТ суттєво відрізнявся серед трьох груп (аналіз P 2). Частота алелю G1326C не суттєво відрізнялася серед усіх груп. Щоб перевірити, чи може SNP G1326C асоціюватися з будь-яким із фенотипів, пов’язаних із ожирінням або діабетом, зокрема індексами резистентності до інсуліну, ми порівнювали клінічні та метаболічні параметри (ІМТ, глюкоза в крові, інсулін, HOMAIR та ліпідний профіль) між носіями та неносіями SNP G1326C. Знову ж, суттєвої різниці не виявлено (дані не відображаються).

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Пацієнти.

Молекулярно-генетичний скринінг.

Варіанти послідовності гена резистину аналізували методом PCR-SSCP, як описано раніше (3). Коротко кажучи, праймери були розроблені для включення меж інтрон-екзон, щоб оцінити можливі мутації в місцях сплайсингу, а також включити 5 ′ регуляторну область та 3′-UTR (таблиця 1). Для підтвердження очікуваної нуклеотидної послідовності три фрагменти ПЛР, що відповідають трьом екзонам, були проаналізовані шляхом прямого секвенування за допомогою набору PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing kit та автоматизованого секвенсора ABI 310 (Applied Biosystems, Мілан, Італія) відповідно до інструкцій виробника.

Після ампліфікації ПЛР фрагменти ДНК електрофорезували в гелі 1 × MDE (Посилення виявлення мутацій) (FMC BioProducts, Рокленд, Мен) та візуалізували за допомогою фарбування сріблом. Всі екзони, що не демонструють варіантів SSCP за цим методом, були електрофорезовані у 12% поліакриламідному гелі в буфері 1 × TBE і працювали при кімнатній температурі при константі 25 мА протягом 14–16 год, з 5% гліцерином та без нього.

Варіанти SSCP досліджували методом прямого секвенування, як описано вище. Як повідомляється, метод SSCP (11) має чутливість 90% при використанні, як у цьому дослідженні, у двох гелевих умовах; таким чином, слід визнати, що існує 10% ймовірності того, що невідомі SNP могли бути пропущені.

За допомогою Webcutter 2.0 (www.firstmarket.com/cutter/cut2.html) було встановлено, що варіант G1326C в екзоні 3 гена резистину створює сайт рестрикції BseRI, що призводить до наявності двох смуг 235 і 21 bp. Таким чином, розщеплення ферментом рестрикції 256-bp-фрагмента ПЛР екзону 3 проводили при 37 ° C протягом 1,5 год у 22-мкл реакціях, що містять 12 мкл продукту ПЛР, 2,2 мкл буфера та 6 одиниць ферменту рестрикції BseR1. Фрагменти аналізували на 4% гелі високої роздільної здатності, забарвленому бромідом етидію.

Статистичний аналіз.

Категоричні змінні порівнювали за допомогою χ 2 або точного критерію Фішера. Відмінності між неперервними змінними оцінювали двостороннім t-критерієм Стьюдента. Розподіл генотипів між досліджуваними групами порівнювали за таблицями непередбачених ситуацій 2 × 2 та 2 × 3 та аналізом χ 2.