Фізіологічні та біохімічні зміни, пов’язані з розвитком та старінням квітів у поки що не досліджених Helleborus orientalis Lam. Резюме. Олімпік

Васім Шахрі

Кафедра ботаніки Кашмірського університету, Срінагар, 190006 Індія

Інаятулла Тахір

Кафедра ботаніки Кашмірського університету, Срінагар, 190006 Індія

Шейх Таджамул Іслам

Кафедра ботаніки Кашмірського університету, Срінагар, 190006 Індія

Муштак Ахмад Бхат

Кафедра ботаніки Кашмірського університету, Срінагар, 190006 Індія

Анотація

Вступ

Рослини Helleborus orientalis у повному розквіті

Матеріали і методи

Рослинний матеріал

Були використані квіти Helleborus orientalis, що ростуть в університетському ботанічному саду. Розвиток та старіння квітів було розділено на шість стадій на основі різних морфологічних ознак (табл. 1, рис. 2а). Ці стадії визначали як стадію щільних бруньок (I), стадію зрілих бруньок (II), напіврозкриту стадію (III), повністю відкриту стадію (IV), частково зелену стадію (V) та зелену чашолисткову стадію (VI). Видимі зміни були зафіксовані протягом розвитку квітки та старіння.

Таблиця 1

Різні морфологічні ознаки, на основі яких були виявлені наступні етапи під час розвитку квітки та старіння у Helleborus orientalis cv. Олімпік

Етап розвитку квітки та старіння Особливості

I (стадія щільних бруньок)	Бруньки повністю закриті; Чашолистки зеленуватого кольору
II (стадія зрілих бруньок)	Бутони закриті; Чашолистки кремового кольору
III (Напіввідкрита сцена)	Квіти напіврозкриті; Чашка у формі; Усі тичинки та нектарники скупчені в центрі, що охоплює маточки; Маточки не видно; Квіти кремово-білого кольору
IV (повністю відкрита сцена)	Квіти повністю розкриті; Блюдце у формі; Зовнішні мутовки тичинок відокремлені від центрального скупчення; Маточки видимі; Нектари зеленуваті; Чашолистки кремово-білого кольору
V (Частково зелена стадія)	Квіти повністю розкриті; Блюдце у формі; Зовнішні мутовки тичинок випадають, тоді як деякі внутрішні муточки оточують маточки; Маточки повністю видно; Нектари висохли і набули коричневого кольору. Початок повторного озеленення з базальної частини чашолистків
VI (Зелений чашолисток)	Квіти повністю розкриті; блюдце у формі; Всі тичинки та нектари вирвані. Збільшені зеленуваті маточки в центрі, які переростають у фолікули; чашолистки повністю зелені.

a Етапи розвитку квітів та старіння у Helleborus orientalis. Зверніть увагу, що під час старіння чашолистки зеленіють (етапи V і VI). b Збільшення розміру маточки під час розвитку квітки та старіння

Квітковий діаметр, свіжа маса, суха маса та проникність мембрани

Діаметр, свіжу та суху масу квітів, а також окремих чашолистків визначали на кожному етапі. Суху масу визначали висушуванням матеріалу в печі при температурі 70 ° C протягом 48 годин. Вміст води визначали як різницю між свіжою та сухою масою. Зміни мембранопроникності оцінювали шляхом вимірювання електропровідності (мкС) фільтратів 5 чашолисткових дисків на квітку (діаметром 5 мм), вибитих із зовнішніх ділянок чашолистків п’яти різних квіток, інкубованих у 15 мл скляній дистильованій воді протягом 15 год при 20 ° С.

Оцінка цукру, амінокислот та фенолів

На кожному етапі 1 г подрібненого матеріалу тканини чашолистка фіксували в гарячому 80% етанолі. Матеріал тричі мацерували і центрифугували. Супернатанти об’єднували та використовували для вимірювання кількості цукрів, амінокислот та загального вмісту фенолів. Відновлення цукру визначали методом Нельсона (1944) з використанням глюкози як стандарту. Загальний розчинний цукор оцінювали після ферментативного перетворення невідновлюваних цукрів у відновлюючі цукру з інвертазою (BDH). Невідновлюваний цукор розраховували як різницю між загальним і відновлюючим цукрами. α-амінокислоти оцінювали методом Rosen (1957), використовуючи гліцин в якості стандарту. Загальний вміст фенолів оцінювали методом Swain and Hillis (1959), використовуючи галлову кислоту як стандарт.

Оцінка рівня білка та активності протеази

Білки витягували з 1 г тканини чашолистка, окремо взятих з різних квітів. Тканину гомогенізували в 5 мл 5% сульфіту натрію (мас./Об.), Додаючи 0,1 г полівінілпіролідону (PVP), і центрифугували. Білки осаджували з відповідного об'єму очищеного супернатанту з рівним об'ємом 20% трихлороцтової кислоти (ТСА), центрифугували при 1000 × g протягом 15 хв і гранулу повторно розчиняли в 0,1 N NaOH. Білки оцінювали з відповідної аликвоти методом Lowry et al. (1951) з використанням бичачого сироваткового альбуміну (BSA) як стандарту.

На кожній стадії 1 г попередньо охолодженої чашолистної тканини гомогенізували в 15 мл охолодженого 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,5) у попередньо охолодженому скляному маточці та ступці. Вміст видавлювали через чотири шари муслінової тканини і центрифугували протягом 15 хв при 5000 × g в центрифузі (Remi K-24) у холодильнику при -5 ° C. Супернатант використовували для аналізу активності протеази методом Tayyab and Qamar (1992) із модифікацією. Реакційна суміш включала 1 мл 0,1% BSA, розчиненого в 0,1 М фосфатному буфері (pH 6,5). Реакцію зупиняли додаванням 2 мл 20% холодного ТСА. Заготовки, до яких додавали ТСА перед додаванням ферментного екстракту, запускали разом із кожним зразком. Вміст центрифугували і збирали супернатанти. Вільні амінокислоти оцінювали (як еквіваленти тирозину) у відповідній аліквоті супернатанту методом Lowry et al. (1951) з використанням тирозину в якості стандарту. Специфічна активність ферменту виражається як мкг еквівалентів тирозину, що виділяються на мг білка в тканинному екстракті.

SDS-PAGE

На кожній стадії гомогенізували 1 г тканини чашолистка в 1 мл екстракційного буфера (0,1 М рН 7,2) і 100 мг ПВП. Суміш центрифугували при 5000 × g при -5 ° C в охолодженій центрифузі (Remi K-24) протягом 15 хв. Супернатант збирали і використовували для SDS-PAGE. Екстраговану білкову суміш денатурували змішуванням рівних обсягів білкової суміші та 2X буфером для завантаження зразків (0,5 М Tris pH 6,8, 10% SDS, 10% гліцерину, 5% β-меркаптоетанолу, 0,1% бромфенолового синього). Суміш інкубували в окропі протягом 5 хв. Концентрацію білка визначали як у вихідних екстрактах, так і в зразках, осаджених TCA, методом Lowry et al. (1951) з використанням BSA як стандарту.

Одновимірний вертикальний гелевий електрофорез проводили за методикою, описаною Ausubel et al. (1989). Гелі для плит товщиною 0,7 мм, що містять 12% гелю. 80 мкл денатурованого SDS екстракту білка завантажували в кожну смугу. Електрофорез проводили при кімнатній температурі з постійною напругою 50 В під час укладання та 150 В під час роботи. Стандарти молекулярної маси GENEI використовували для визначення приблизних молекулярних ваг (міозин, м’язи кролика 205 000; фосфорилаза b 97 400; бичачий сироватковий альбумін 66 000; овальбумін 43 000; вуглекисла ангідраза 29 000; апротинін 6500; інсулін (α та β ланцюги) 3000). Після електрофорезу гелі фарбували протягом ночі в 0,25% блискучого синього кумасі у 45% метанолі: 10% оцтової кислоти. Гелі одержували у 45% метанолі: 10% оцтової кислоти, потім у 7% метанолі: 5% оцтової кислоти.

Статистичний аналіз

Кожне значення, представлене в таблицях, відповідає середньому значенню ± ЗЕ від п'яти до десяти незалежних копій.

Результати

12% SDS-PAGE однакової кількості білка, що піддається екстракції, на різних стадіях (від I до VI) розвитку та старіння квіток з тканин чашолистків Helleborus orientalis. Гель фарбували синім кумасі. Числа над провулками відповідають стадіям розвитку. Норми молекулярної маси вказані зліва (кДа), а ca молекулярні маси основних поліпептидів праворуч від гелю (кДа)

Обговорення

Свіжа і суха маса, вміст води та розчинні вуглеводи квітів, а також окремих чашолистків показали збільшення тканин чашолистка в процесі квіткового розвитку від бутона до повністю розкритого цвітіння, після чого під час старіння виявлено тенденцію до зниження. Встановлено, що зменшення свіжої та сухої маси квітів частково зумовлене випаданням тичинок та нектарів, а частково - зменшенням свіжої та сухої маси окремих чашолистків. Було показано, що квіти (тканини чашелишків/пелюсток) під час старіння перетворюються з раковини на джерело, а такі зміни, як падіння свіжої маси, суха маса та розчинні вуглеводи, часто пов’язані з ПХД (Zhou et al. 2005). Виявлено, що дозрівання та старіння квіток супроводжується зниженням загального вмісту розчинних вуглеводів у різних квітках, таких як гвоздики, гемерокаліси, іриси та троянди (Nichols 1973; Paulin and Jamain 1982; Lukaszewski and Reid 1989; Lay-yee et al. 1992; Beileski 1993; Mwangi et al. 2003; Gulzar et al. 2005; Reid 2005). Існує припущення, що метаболізм цукру активний у застарілих клітинах, оскільки багато вуглецевих скелетів, ремобілізованих з макромолекул, вивозиться з пелюстки, головним чином, як сахароза (van Doorn and Woltering 2008).

Під час поточного дослідження було помічено, що спостерігалося помітне збільшення активності протеази в міру просування квіток до старіння. Активність була співмірною з різким зменшенням розчинних білків. Експресія транскриптів, що кодують протеази, є однією з найбільш ранніх генних змін, пов'язаних зі старінням (Eason et al. 2002). Помітне підвищення активності протеази під час старіння пелюсток було також зареєстровано у таких квітів, як Hemerocallis, Iris і Petunia (Stephenson and Rubinstein 1998; Pak and van Doorn 2005; Jones et al. 2005). Це дослідження показує, що, хоча рівень загального білка може швидко знижуватися після розкриття квіток, SDS-PAGE виявив зменшення білків з більшою молекулярною масою, тоді як вміст білків з низькою молекулярною масою збільшився. Це підтверджує подібні знахідки щодо квітів, таких як гібіскус та гемерокаліс (Woodson and Handa 1987; Courtney et al. 1994). На цьому етапі ми не знаємо, чи мають поліпептиди, які збільшувались під час старіння, молекулярну масу приблизно. 15,8 і 29,5 кДа відіграють важливу роль у старінні квітів Helleborus orientalis.