Ефект проти ожиріння хмелю, отриманого пренілфлавоноїдного ізоксантогумолу, на моделі ожиріння миші з ожирінням, спричиненою дієтою

Шинья ФУКІЗАВА

1 Науково-дослідний інститут, Suntory Global Innovation Center Ltd., 8-1-1 Seikadai, Seika-cho, Soraku-gun, Кіото 619-0284, Японія

Май ЯМАШІТА

1 Науково-дослідний інститут, Suntory Global Innovation Center Ltd., 8-1-1 Seikadai, Seika-cho, Soraku-gun, Кіото 619-0284, Японія

Кен-ічі ВАКАБАЯШІ

1 Науково-дослідний інститут, Suntory Global Innovation Center Ltd., 8-1-1 Seikadai, Seika-cho, Soraku-gun, Кіото 619-0284, Японія

Шихо ФУДЖІСАКА

2 1-й відділ внутрішньої медицини, Університет Тоями, 2630 Сугітані, Тояма-ши, Тояма 930-0194, Японія

Казуюкі TOBE

2 1-й відділ внутрішньої медицини, Університет Тоями, 2630 Сугітані, Тояма-ши, Тояма 930-0194, Японія

Юдзі НОНАКА

1 Науково-дослідний інститут, Suntory Global Innovation Center Ltd., 8-1-1 Seikadai, Seika-cho, Soraku-gun, Кіото 619-0284, Японія

Норіхіто МУРАЯМА

1 Науково-дослідний інститут, Suntory Global Innovation Center Ltd., 8-1-1 Seikadai, Seika-cho, Soraku-gun, Кіото 619-0284, Японія

Анотація

ВСТУП

Харчові звички змінюються у всьому світі, і все більше людей, особливо в розвинених країнах, страждають ожирінням. Ожиріння сприяє виникненню метаболічного синдрому, який характеризується абдомінальним ожирінням, атерогенною дисліпідемією, підвищенням артеріального тиску, інсулінорезистентністю, прозапальними та протромботичними станами [1,2,3]. За даними останнього опитування 2015 року, приблизно у 604 мільйонах дорослих та 108 мільйонів дітей діагностовано ожиріння у 195 країнах [4]. В огляді 11 досліджень ожиріння в дитячому та юнацькому віці негативно впливало на смертність та захворюваність (діабет, гіпертонія, ішемічна хвороба серця та інсульт) у зрілому віці [5, 6]. Таким чином, очевидно, що необхідні профілактичні заходи для зменшення поширеності ожиріння [7].

Незважаючи на те, що фармацевтичні компанії працюють над розробкою ефективних препаратів проти ожиріння, ці препарати страхуються лише у пацієнтів, яким важко дотримуватися дієти або займатися спортом. Оскільки ожиріння виникає внаслідок дисбалансу між спожитими та витраченими калоріями [8], запобігання ожирінню шляхом зміни дієтичних звичок є важливим. Деякі природні інгредієнти, отримані з сировини, можуть допомогти вирішити проблему ожиріння [9]. Наприклад, клінічне випробування показало, що глікозиди кверцетину ефективні для зменшення вісцерального жиру у здорових дорослих [10]. Кверцетин виражає ліполітичну активність у жировій тканині шляхом посилення вивільнення гліцерину та фосфорилювання гормоночутливої ліпази в адипоцитах 3T3-L1 [11]. Подібним чином чайні катехіни покращують ліпідний обмін завдяки бета-окислювальній активності в печінці, припускаючи, що вони можуть сприяти придушенню ожиріння [12].

Нещодавно в декількох звітах висловлюється припущення, що мікробіом пов'язаний із прогресуванням ожиріння. Наприклад, співвідношення твердих речовин та бактероїдетів вище у людей із ожирінням у Японії порівняно з небідними суб'єктами [13]. Дослідження на тваринах показало, що трансплантація мікробіоти мишам, що страждають ожирінням, на вільних від зародків мишей (GF), сприяло патофізіології ожиріння [14]. Коли мікробіоти калу від самок мишей з ожирінням пересаджували мишам GF, загальна вага тіла та жирова маса збільшувались [15]. Ці звіти підтверджують значення мікробіомів при розгляді основного механізму ожиріння.

Деякі харчові інгредієнти, включаючи клітковину та поліфеноли, можуть змінити мікробіом [16]. Наприклад, у клінічному дослідженні епігалокатехін-3-галлат (EGCG) та ресвератрол отримували добровольці протягом 12 тижнів. Після втручання рівень бактеріоїдетів у мікробіомі знизився [17]. Рівні окиснення жиру, які можна виміряти за допомогою непрямої калориметрії, були пов’язані з вихідним вмістом Bacteroidetes [17]. Ці результати підтверджують взаємозв'язок між мікробіомом та фенотипами та підвищують ймовірність впливу харчових інгредієнтів на мікробіом.

Як повідомляється, ксантогумол, похідний хмелю (Humulus lupulus), пренілфлавоноїд, корисний для здоров’я. Ксантогумол інактивує білки, що зв’язують регуляторні елементи стеролу (SREBP), і зменшує синтез жирних кислот, припускаючи, що він може регулювати метаболізм ліпідів та покращувати ожиріння [18]. Він також пригнічує ангіогенез у клітинних лініях аденокарциноми підшлункової залози людини та мишей BALB/c, припускаючи, що він має потенціал як протираковий препарат [19]. Ксантогумол проявляє широкий спектр антипатогенної активності [20]. Однак, хоча це терапевтична сполука, яка є кандидатом для вирішення різних проблем зі здоров’ям, за певних умов (наприклад, високі температури) вона може бути ізомеризована у пренілфлавоноїд, який називається ізоксантогумол (IX) [21]. IX більш стійкий до нагрівання, ніж ксантогумол, і це типова сполука, що утворюється в процесі заварювання [22]. Хоча IX має бажані ознаки як функціональної сполуки, мало інформації про його біоактивність. На сьогоднішній день повідомляється, що IX інактивує деградацію форм попередників SREBP у клітинах Huh-7, припускаючи, що він також може регулювати синтез жирних кислот [23]. Однак незрозуміло, чи має IX ефект проти ожиріння in vivo чи змінює склад мікробіома.

Це дослідження мало на меті дослідити, чи IX може вплинути на прогресування ожиріння на мишачій моделі, і чи можуть зміни мікробіома мати відношення до ефекту IX. З цією метою ми оцінили накопичення вісцерального жиру та збільшення маси тіла, використовуючи дієтичну індуковану ожиріну модель миші після перорального лікування IX протягом 8 тижнів. Потім ми оцінили склад мікробіома, використовуючи секвенування гена 16S рРНК. Щоб з’ясувати взаємозв’язок між мікробіомом та ефектом ожиріння IX, ми оцінили ефект ожиріння IX, використовуючи мишей GF. Ми також проаналізували експресію печінкових генів Acyl-CoA оксидази (Acox1) та карнітинпальмітоїлтрансферази 1a (Cpt1a) через 2 тижні введення IX. Ми відібрали ці два гени, Acox1 і Cpt1a, оскільки вони є обмежуючими швидкість ферментами окислення жирних кислот і пов’язані з ожирінням [12, 24].

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Препарат IX та ксантогумолу

IX та ксантогумол очищали від комерційного екстракту хмелю, придбаного у Asama Chemical Co., Ltd. (Токіо, Японія), використовуючи колоночну хроматографію з нормальною та оберненою фазою. Чистота IX та ксантогумолу була підтверджена на основі поглинання ультрафіолету як при 280 нм, так і при 350 нм, за допомогою високоефективної рідинної хроматографії. Очищені продукти з площею піку IX вище 95% щодо загальної абсорбції використовувались у наступних експериментах.

Ефект проти ожиріння IX у моделі ожиріння мишей з ожирінням, спричиненою дієтою

Самці мишей C57BL/6 J (віком 7 тижнів) були придбані у CLEA Japan, Inc. (Токіо, Японія). Протягом експерименту мишам було дозволено доступ до їжі та води за умови, і вони підтримувались при 25 ± 1 ° C та 60 ± 5% вологості під час 12-годинного циклу світло-темрява. Тварин годували комерційною дієтою (D12450B [контроль]; Research Diets, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі, США) протягом 1 тижня. Після цього мишей випадковим чином розподіляли на 7 груп (n = 8 на групу) на основі маси тіла і розподіляли за таких умов: нормальна дієта (ND), дієта з високим вмістом жиру (HFD), що складається з 60% ккал від жиру (D12492; Дієти досліджень), катехіни HFD та чаю 300 мг/кг (HFD + C; як позитивна контрольна група), HFD та середні дози (60 мг/кг) ксантогумолу (HFD + XN-M), HFD та низькі -доза (L; 20 мг/кг) IX (HFD + IX-L), HFD та середні дози (M; 60 мг/кг) IX (HFD + IX-M), і HFD та високі дози (H; 180 мг/кг) IX (HFD + IX-H).

IX, ксантогумол та препарат для чайних катехінів (поліфенон 70А, Mitsui Norin Co., Ltd., Токіо, Японія) розбавляли у 0,5 мас.% Водного розчину натрієвої солі карбоксиметилцелюлози (Kanto Chemical Co., Inc., Токіо, Японія) та перорально давали мишам C57BL/6 J один раз на день протягом 8 тижнів за допомогою голки для годування. Ваги тіла вимірювали двічі на тиждень за допомогою електронних ваг (GX-6000, A&D Company, Ltd., Токіо, Японія). В останній день введення мишей забивали під анестезією ізофлурану, і збирали такі тканини: вісцеральну жирову тканину (епідидимальний жир, периренальний жир та мезентеріальний жир) та вміст сліпої кишки. Кожен зразок збирали окремо в 1,5 мл пробірку, висушували ліофілізацією і зберігали при температурі близько -80 ° C до аналізу. Подібним чином, незабаром після розсічення ми вимірювали ваги кожної вісцеральної жирової тканини, включаючи епідидимальний жир, периренальний жир та брижовий жир. Всі експерименти проводились у 2017 р. Всі протоколи процедур на тваринах були затверджені Комітетом з етики експериментів на тваринах відповідно до Внутрішніх положень про експерименти на тваринах у Санторі, які базуються на Законі про гуманне поводження з тваринами та поводженні з ними (Закон № 105, 1 жовтня 1973 р. Із змінами, внесеними 2 червня 2017 р.).

Аналіз мікробіома кишечника з використанням вмісту сліпої кишки

Експресія печінкових генів, пов’язана з бета-окисленням жирних кислот

Додатковий експеримент був проведений для дослідження експресії печінкових генів, пов’язаної з бета-окисленням жирних кислот. Для оцінки короткочасних ефектів щоденне пероральне введення препарату IX повторювали протягом 2 тижнів із використанням індукованої HFD моделі ожиріння миші. Умови тварин та обробка перед годуванням були такими ж, як і експерименти вище. Мишей випадковим чином розподіляли на 4 групи (n = 8 на групу) і розподіляли за таких умов: ND, HFD, HFD та низькі дози (30 мг/кг) IX (HFD + IX-L ') та HFD + IX -М. Дози IX становили 30 і 60 мг/кг. Після багаторазового введення протягом 2 тижнів усіх мишей забивали під анестезією ізофлураном, а тканини печінки збирали та піддавали кількісній ПЛР у реальному часі. Загальну РНК виділяли з тканин печінки за допомогою реагенту QIAzol та набору RNeasy (QIAGEN). Потім для синтезу кДНК використовували набір для зворотної транскрипції кДНК високої ємності (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Кількісну ПЛР у реальному часі проводили з використанням загальної суміші TaqMan Fast Universal PCR Master (Thermo Fisher Scientific Inc.) та специфічних праймерів 2 генів: Acox1 та Cpt1a. Рівень експресії генів корелював з рівнем генів 18S рРНК.

Ефект проти ожиріння IX на мишей GF

Експеримент із використанням самців мишей C57BL/6N GF був проведений в Sankyo Labo Service Corporation, Inc. (Ібаракі, Японія). Протягом експерименту мишей вирощували всередині ізолятора для контролю їх впливу вірусних, бактеріальних або паразитарних агентів. Мишам було дозволено доступ до їжі та води за умови, і їх підтримували при 23 ± 3 ° C та 55 ± 15% вологості під час 12-годинного циклу світло-темрява. Щоб дослідити участь мікробіому в накопиченні жиру та збільшенні ваги, ми досліджували можливий ефект ожиріння IX на мишей GF протягом 8 тижнів (починаючи з 7-тижневого віку). Мишей GF розподіляли випадковим чином на 5 груп (n = 8 на групу) залежно від маси тіла та розподіляли за наступних умов: ND, HFD, HFD + C, HFD + IX-M та HFD + IX-H. Дози IX становили 60 та 180 мг/кг. В останній день вимірювали вагу тіла. Потім мишей жертвували під анестезією ізофлураном, а вісцеральні жирові тканини, епідидимальний жир, периненальний жир та мезентеріальний жир збирали для вимірювання ваги.

Статистичний аналіз

Всі дані представлені як середні значення ± SE. Для статистичного аналізу була використана версія IBM SPSS Statistics 23 (IBM, Armonk, NY, США). Для порівняння більш ніж 2 груп використовували тест Даннета. T-тест Стьюдента використовували для 2 незалежних груп (наприклад, ND та HFD). Різниці вважались значними на p рис. 1), а ваги всіх жирових тканин - епідидимальний жир (рис. 2А), навколоповерховий жир (рис. 2В) та брижовий жир (рис. 2С) - мишей, які годували HFD, були значно вище, ніж тих, хто харчується НД. У групах HFD + C та HFD + IX-H маса тіла та вага усіх жирових тканин були значно нижчими, ніж у групі HFD. У групах HFD + IX-M та HFD + XN-M лише маса брижового жиру була значно нижчою, ніж у групі HFD. Істотних відмінностей у кількості споживаних дієт між групою HFD та іншими групами не спостерігалося. Пероральне введення IX, а також ксантогумол та катехіни чаю пригнічували індуковане HFD накопичення вісцерального жиру та збільшення маси тіла на HFD-індукованій моделі ожиріння миші.

Вплив перорального прийому ізоксантогумолу, ксантогумолу та катехінів чаю протягом 8 тижнів на зміну маси тіла на моделі ожиріних мишей з ожирінням, спричиненою дієтою. Дані представлені як середнє значення ± SE 8 мишей. * p # p Рис. 3A). На рівні роду відносна чисельність Akkermansia muciniphila, Blautia, Escherichia coli, Bacteroides, Prevotella та Eubacterium була значно вищою в групах HFD + IX-M та HFD + IX-H, ніж у групі HFD (рис. 3B) . Відносна чисельність A. muciniphila становила 23% та 24% від загального мікробіома у групах HFD + IX-M та HFD + IX-H відповідно, тоді як A. muciniphila не виявлялася в групах ND та HFD (межа виявлення для відносної чисельності: 0,005%). Варіації в межах підгруп спостерігались у групі HFD + C. A. muciniphila було підтверджено лише у 4 з 8 мишей, причому вона була під межею виявлення у інших 4 мишей (рис. 3С). Відносна чисельність блаутії становила 8% та 10% від загального мікробіома у групах HFD + IX-M та HFD + IX-H відповідно, тоді як на Blautia припадало менше 1% у групах ND та HFD. На відміну від цього, відносна кількість осцилоспір, лактококів, дегалобактерій, анаеротрунку та румінококів була значно нижчою у групах HFD + IX-M та HFD + IX-H, ніж у групі HFD (рис. 3B). В цілому, пероральне лікування IX протягом 8 тижнів змінило склад мікробіома.

Мікробний склад сліпої кишки після перорального прийому ізоксантогумолу та катехінів чаю протягом 8 тижнів на рівні (A) типу та (B) для Akkermansia muciniphila, а також (C) окремих даних. Дані представлені як засоби 8 мишей. Для (A) рівня філу, #p Рис. 4A, 4B). Відносні рівні експресії Acox1 показали збільшення в 1,3 та 1,6 рази у групах HFD + IX-L ’та HFD + IX-M порівняно з групою HFD відповідно. Відносні рівні експресії Cpt1a показали збільшення у 1,5 та 1,7 рази у групах HFD + IX-L ’та HFD + IX-M порівняно з групою HFD відповідно.

Рівні експресії мРНК (A) ацил-КоА оксидази (Acox1) та (B) карнітинпальмітоїлтрансферази 1a (Cpt1a) у печінці після перорального прийому ізоксантогумолу протягом 2 тижнів. Дані представлені як середнє значення ± SE 8 мишей. * p Рис. 5A) та ваги всіх жирових тканин - епідидимальний жир (рис. 5B), периренальний жир (рис. 5C) та мезентеріальний жир (рис. 5D) - були значно вищими в групі HFD, ніж у ND групи. Однак не було значущих відмінностей у кінцевій масі тіла та вазі будь-якої жирової тканини між групою HFD та іншими групами втручання (HFD + C, HFD + IX-M та HFD + IX-H). Загалом пероральне введення IX мало впливало на індуковане HFD накопичення вісцерального жиру та збільшення маси тіла на моделі миші GF.

Хоча було показано, що IX регулює склад мікробіома, це не обов'язково означає, що зміна мікробіому пов'язане з придушенням ожиріння. Щоб підтвердити цю взаємозв'язок, ми досліджували ефект IX за допомогою моделі миші GF, в якій вплив мікробіому можна ігнорувати. У мишей GF збільшення маси тіла та накопичення вісцерального жиру були більш помірними, ніж у мишей, які не були GF (рис. 1, 2 2 та 5). 5). Ці дані узгоджуються з попереднім звітом, який демонструє внесок мікробіома у збільшення маси тіла та накопичення жиру [31]. Отже, IX не виявляв значного ефекту проти ожиріння у мишей GF. На основі цих висновків ми можемо припустити, що ефект ожиріння IX пов'язаний із змінами мікробіома. Хоча деякі кишкові бактерії можуть сприяти ожирінню при порівнянні результатів мишей GF та не GF, A. muciniphila або Blautia можуть представляти бактерії проти ожиріння. Чаєві катехіни не мали значних ефектів проти ожиріння у мишей GF, хоча існували зміни в мікробіомі в межах підгруп, наприклад, щодо відносної чисельності A. muciniphila. Не ясно, чи основний механізм ефекту проти ожиріння чайних катехінів такий самий, як механізм IX.

На закінчення, отриманий хмелем пренілфлавоноїд IX показав активність проти ожиріння та здатність змінювати склад мікробіома у мишей. Склад мікробіома пов'язаний з ефектом ожиріння IX, оскільки IX не виявляв значних ефектів проти ожиріння у мишей GF. Залишається незрозумілим, чи збільшення відносної чисельності A. muciniphila та Blautia безпосередньо пов’язане з ефектом проти ожиріння. Оскільки IX більш стійкий до нагрівання, ніж ксантогумол, він може бути корисним у розробці харчових продуктів, що мають переваги проти ожиріння. Для підтвердження наших висновків необхідні майбутні клінічні дослідження.